بیماری آنفولانزای طیور (قسمت دوم)



مدیریت بیماران :
گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمایشگاه برای تست آنفولانزا و دیگر عفونتهایی كه علائم بالینی مشترك دارند .
درمان با اینهیبیتور نورآمینیدازها مانند oseltamivir (بصورت 75mg خوراكی ، دوبار در روز) بعنوان اولین مراحل درمان بكار میرود .
اگر كه علائم بالینی ظاهرشد بیمار بایستی در بخشی كه قبلاُ توضیح داده شد برای كنترل عفونت بستری گردد.
اگر كه تشخیص داده شد بیمار نیاز به بستری شدن ندارد بایستی به بیمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردی و كنترل عفونت (برای مثال: شستن دستها، استفاده از ماسك كاغذی یا جراحی برای شخص بیمار وپرهیز از تماس جمعی) آموزش داده شود اگر كه نیاز دارد توسط دارو تحت درمان حمایتی قرار گیرد همچنین بیمار با پزشك معالج توسط تلفن ویا ویزیت شدن در تماس باشد .درمانهای حمایتی شامل مراقبت از اشباع بودن اكسیژن واستفاده از ذخیره اكسیژن در صورت كم شدن اكسیژن ماسكهای اكسیژن nebulizer ویا high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسی برای پیشگیری از انتشار تنفسی بكار می رود .

این توصیه ها فقط هنگامی كه بیماری شدید باشد و كنترل آن مشكل می باشد مورد نیاز هستند .
گرفتن نمونه های خون وتنفسی بطور مرتب برای چك كردن عفونتهای باكتریایی احتمالی مورد نیاز می باشد . استفاده از درمان آنتی بیوتیكی به صورت تزریقی را نیز باید در نظر داشت . از آمانتیدین یا ریمانتیدین استفاده نكنید بدلیل خطر افزایش موتاسیون انتخابی در جهت مقاومت ویروسی با توانایی جهانی شدن . نتایج اولیه كه توسط مراكز مختلف بهداشت جهانی بدست آمده پیشنهاد می كند كه ویروس آنفولانزای A (H5N1) كه اخیراُ از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتیدین وریمانتیدین مقاوم می باشند .
پرهیز از تجویز سالیسیلاتها (مانند آسپیرین) در بچه های زیر 18سال بدلیل ریسك سندرم reye .
استفاده از paracetamol یا ibuprofen با هم بصورت خوراكی یا شیافت برای كنترل تب.

تعدیل كنندهای سیستم ایمنی مانند كورتیكواستروئیدها بایستی فقط به موازات عملیات كلینیكی صورت گیرد. پاسخ ایمنی انسان در مقابل آنفولانزای A (H5N1) هنوز نیاز به مطالعات بیشتری دارد .
از ribavirin استفاده نكنید. هیچگونه شواهدی دال بر مؤثر بودن این دارو بر علیه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمی شایع می باشد و ممكن است كه بیمار را بیشتر به مخاطره بیاندازد .
برای فهم بهتر الگوی دفع ویروس در انسانهای عفونی شده با ویروسها A (H5N1) در شیوع آنفولانزا در تایلند وویتنام نیاز به مطالعات بیشتری می باشد . تا اینكه شواهد دیگری به دست آید در حال حاضر WHO توصیه كرده است كه ضوابط كنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پیدا كند .
مطالعات قبلی برروی آنفولانزا براین امر كه كودكان باسن كمتراز 12سال می توانند برای 21روز پس از شروع بیماری ویروس را دفع كنند می باشد . بنابراین ، برای كنترل عفونت بهتر است كه كودكان برای این دوره در محل مراقبت باقی بمانند . كودكان در این مدت نبایستی به مدرسه بروند .
افرادی كه بااین بیماران در تماس مستقیم بوده اند بلیستی برای 7روز تحت نظر قرار گرفته شوند ودمای بدن آنها دوبار در روز چك شود اگر كه فردی تب بالاتر از 38c و سرفه یا تنگی نفس را نشان داد بایستی بلافاصله درمان شود .
آنفولانزای مرغی جدید در دانمارك،10000 اردك را ازبین برد .
ویروس A H5N1 در اردكها شناسایی شد .

یك نوع جدید ویروس A آنفولانزا ،H5N1 ، برای اولین بار در اردكهای دانماركی شناسایی شد . بدنبال ظهور بیماری بین 12000 اردك . در یك مزرعه اردك نزدیك به شهر salling در jutland دو ویروس شناسایی شدند: یك ویروس عامل Entritis در اردك (DVE) ،كه عامل بیماری بود ویك ویروس آنفولانزای A .
تمامی اردكها بطور خیلی وسیعی در 10 سپتامبر 2003 درگیر بیماری شدند . ویروس آنفولانزایA از بافت تعدادی از اردكها جدا شد . انستیوسرم سازی statens از RT – PCRطول كامل هماگلوتینین ونورآمینیداز با تعیین توالی روتین كه ترجیحاُ بطور مستقیم برروی نمونه ها انجام می گیرد تا برروی ویروسهای كشت داده شده استفاده كردند و ژنوتیپ این ویروس را H5N7 نام نهادند .


این تایپ قبلاُ هیچ گاه شناسایی نشده بود وبررسی های بیشتر هم اكنون برروی آن در حال انجام است . نكته با اهمیت اینكه این ویروس در انسانها تشخیص داده نشده بخصوص در میان افرادی كه با این اردكها تماس داشتند یا در تعدادی موارد غیر مرتبط ویروس آنفولانزای (H3N2) A در دانمارك از 1 سپتامبر 2003 تشخیص داده شد .12 سویه ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) A از پرندگان وحشی در دانمارك از 1996 جدا شد كه هیچ كدام از آنها H5 یا H7 نبود .
پرندگان وحشی مخزن طبیعی آنفولانزای مرغی هستند (AIV) . اگر چه ویروسهای كم پاتوژن H5 وH7 وجود دارد ولی تمامی ویروسها با بیماری زایی بالا یا H5 یا H7 هستند . پاتوژنسیته ویروسهای AIV H7 و H5 حداقل تا قسمتی وابسته به توالی آمینو اسیدی در محل برش در HA1/HA2 دارد. چنین توالی های پاتوژنیكی یافت نشدند . بنابراین این سویه AIV در گروه ویروسهای باپاتوژنسیته پائین قرار گرفت . توانایی تغییر پاتوژنسیته مثلاُ طی تكثیر در پرندگان یا نوتركیبی در خوكها ویا انسانها شناسایی نشده است . ویروسهای بسیار پاتوژن AIV از تیپ H5 و N7 اغلب انسانها را درگیر می سازند . این مسئله در سال 1997 در هنگ كنگ رخ داد (H5N1) كه 6 نفر از 18 فرد آلوده شده از بین رفتند ودوباره در سال 2003 كه یكی از دو فرد آلوده شده مردند ودر سال 2003 در Netherland سویه H7N7 شایع شد كه 1 نفر از هر 80 بیمار از بین رفتند . سازمان بهداشت جهانی تصویب كرد تمامی كشورها كمیته های بین المللی در مورد مدیریت اپیدمی های آنفولانزا تشكیل گردد .
شبكه های آزمایشگاهی نظارتی و روشهای ژنوتایپ كردن بایستی با كارهای این كمیته های بین المللی هماهنگ شود .
ویروسهای آنفولانزای مرغی عوامل مشترك بین انسان وحیوان می باشند كه بعنوان یك خطر مداوم سلامت جمعیت های انسانی وحیوانی را تهدید می كند . طی 6 سال گذشته، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای مرغی از 3 تحت تیپ (H5, H7, H9) بكرات تشخیص داده شده است .
ویروس آنفولانزای مرغی H7N7 كه سبب آنفولانزای شدید در 225 مزرعه طیور در هلند در سال 2003 شد همراه با عفونت ملتحمه چشم (conjunctivitis) در 347 انسان بود . عفونت با ویروس H7N7 در 87 مورد، مورد تأئید قرار گرفت ، یك نفر دامپزشك در اثر عفونت جان سپرد . شواهدی از انتقال فرد به فرد ویروس و ایجاد عفونت درخوكها دردست می باشد . این شیوع بوسیله جداكردن وقرنطینه كردن طیور عفونی كنترل شد . برای جلوگیری از پدید آمدن وانتشار ویروس نوترتیب مرغی ـ انسانی كارگران مرغداریها بوسیله واكسن آنفولانزای انسانی واكسینه شدند وداروی آنتی نورآمینیداز به آنها داده شد .
انتقال آنفولانزای مرغی H5N1 به انسانها در سال 1997 ثابت كرد كه این ویروس علی رغم اینكه ترجیح می دهدبارسپتورهای سیالیك اسیدمرغی باند شوند توانایی انتقال به انسان رادارد (برای مثال آنهابایك gal 3 و2 × انتهایی لینك می شوند .)
قبل از 1997، گزارشاتی از عفونتهای انسانی باH7N7 وجود داشت (معمولاُ باعث عفونت ملتحمه می شد) ، اما شواهد محكمی دال بر انتقال مكرر ویروسهای مرغی به انسانها دردست نبود . چگونه ویروسهای آنفولانزای مرغی در ایجاد عفونت در پستانداران به طور تصاعدی قوی تر شده اند؟ (متن در مقاله 8)

مقاله شماره (4) :
ارزیابی تلفیق PCR با MOBILITY هترودوبلكس برای تعیین و تشخیص ویروسهای آنفولانزای A از انواع حیوانات :
خلاصه :
انتقال ویروسهای آنفولانزای A از حیوانات میزبان به انسان ممكن است به پدید آمدن گونه های جدید با همه گیری جهانی شود . تشخیص زود بهنگام چنین وقایعی در ابقاء ویروسهای آنفولانزا در درحه اول اهمیت قرار دارد . برای تشخیص و تعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف حیوانات روش توأم RT-PCR و (HMA) heteroduplex mobility طراحی گردید. نشان داده شد كه این تغییر پذیری (m) ژن در RT-PCR می تواند حساس شود و برای تعیین ویروسهای آنفولانزای A انسانی و مرغی وخوكی اختصاصی گردد.
قطعات تكثیر شده توسط PCR از ویروسهای انسان ، طیور وخوك از 15 تحت تیپ مختلف،با بین 9/1 و4/21 اختلاف نوكلئوتیدی بوسیله روش HMA تمایز گذاشته شد .
تعیین توالی ampliconها نشان داد كه الگوی تغییر پذیری هترودوبلكس بااختلاف توالی ها بین DNA مورد آزمایش ورفرنس مرتبط می باشد . متد تكثیرRT-PCR HMA برای جستجوی سریع نمونه ها با یك پانل رفرنس از منشأ ویروسهای انسانی ومرغی وخوكی تشخیص داده شد .
ویروسهای مرغی (A / Hongkong / 1073 / 99) H9N2 كه با گونه های انسانی واكنش متقاطع داشتند در مقابل panel رفرنس مورد بررسی قرارگرفتند . مشخص شد كه محصولات PCRاین سویه بیشترین شباهت را با سویه (A / Quil /Hongkong / GI / 97 ) H9N2 دارد. بررسی توالی ها نشان داد یك اختلاف 101% نوكلئوتیدیبین قطعات amplicon مربوط به A / Quil /Hongkong / GI / 97 و A / Hongkong / 1073 / 99 وجود دارد . با توجه به نتایج كار ما ، روش RT-PCR HMA یك راه سریع و حساس برای جستجوی ویروسهای آنفولانزای جدیدوغیرمعمول
می باشد.شناسایی ویروسهای آنفولانزا معمولاُ شامل رشد ویروس در كشت بافت یا جنین تخم مرغ ، قبل از بررسی تایپها یا ساب تایپها بوسیله ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI) می باشد .
لیكن ، این كارها وقت می برد وشناسایی گونه های منشأ ویروس ضروری نمی باشد . به همین دلیل ماروش (RT) – PCR براساس ژن ماتریكس (M) توأم با روش هترودوبلكس (HMA) mobility برروی محصولات PCR پایه گذاری كردیم .
پروسه خالص سازی نوكلئیك اسیدهای ویروس باشناسایی توسطHMA24 تا36 ساعت وقت می برد و می توان بطور مستقیم آن را برروی نمونه های كلینیكی انجام شود . روش RT-PCR HMA كه در اینجا شرح داده می شود به تشخیص زود به هنگام انتقال داخل گونه ای بین میزبانهای انسانی وحیوانی كمك خواهد كرد .

مواد و روشها :
جداسازی ویروس :

ویروسهای آنفولانزا درحفره های آلانتوئیك جنین تخم مرغ رشد می كند . مایع حاوی مایع آلانتوئیك جداسازی شده ودردمای 70c تا موقع مورد نیاز نگهداری
می شود . ویروسهایی كه در این مطالعه استفاده شده اند در جدول شماره 1 لیست
شده اند .
ویروسهای /Taiwan/7310/10 ، A/SW/oms/2899/82 ، A/SW/oms/3633/84، /SW/Scotland/410440/94 ، A/SW/hongkong/168/93 ،A/HK/1774/99 و A/HK/1073/99 بوسیله yipu lin و alan hay مؤسسه بین المللی تحقیقات پزشكی در mill hill انگلستان فراهم شد .
جدا سازی A/DUCK/singapor q/f 119-3/97 بوسیله آزمایشگاه دامپزشكی منشعب از مركز دامپزشكی سنگاپور انجام گرفت .
ویروس تایپنگ : ویروسهای آنفولانزا كه تایپ می شوند با استفاده از آنتی سرم موش خرما همانطوری كه قبلاُ شرح داده شد انجام می شد . تمام تستهای HI با استفاده از HAU 8 از ویروسها و 5% سلولهای قرمز (vol/vol) turkey انجام گرفت .

سنتز cDNA وخالص سازی نوكلئیك اسید :
RNA ویروسی از یك میزان 150mg از نمونه بوسیله روش باند شدن با گوآنیدینوم تیوسیانات باسیلیكا همانطوری كه قبلاُشرح داده شد انجام گرفت . rna ویروسی در 30 از نوكئازها وآب آزاد حل می شود .
RT از RNA به CDNA بوسیله اضافه كردن 2/22 از RNA به 8/17 مخلوط RT حاوی 20Mm Tris-Hcl (PH=8/4) ، 50 Mm ، KCL و 7/5 Mm ، mgcl2 و 3Mm از هر داكسی نوكلئوتید تری فسفات و 25ng از پرایمرهای راندم (pdn6) و 1/6 u از rnasine و2007 از revers transcriptase ویروس لوسمی موشی (moloney) انجام می شود .
این مخلوط در دمای 20c برای 10 دقیقه انكوبیت می شود وسپس در 37c برای 45 دقیقه نگهداری می گردد . سپس نمونه ها برای 65 دقیقه تا 100c حرارت می بینند وبعد روی یخ گذاشته می شوند .
مواد اصلی PCR : توالی های پرایمر بدنبال بررسی نواحی حفاظت شده از ژن m مربوط به ویروسهای آنفولانزای A بدست آمدند.خصوصیات پرایمرها بانرم افزار oligo primer analysis بررسی می شوند .جفت پرایمری كه در مایه RT- PCR مربوط به m gene مورد استفاده قرار می گیرددر جدول شماره 2 آمده است.
پرامر خارجی ،amp71f قبلاُ برای استفاده در یك مایه pcr برای تعیین ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده است . هر جفت پرایمر در مجاورت مقدار مشخصی از mgcl2 ، نمك و PH انجام می گیرد. برای PCR اولیه، 20 L از cdna به 80 L مخلوط PCR حاوی 8 L از بافر 10XPCR ((PH : 8/4) tris- hcl , 200Mm و kcl 500ml ) و2/4 l از mgcl2 50mm و 1 l ازهرپرایمر خارجی در l (amp 71f ,amp831r ) 5 pmol/ و 6/7/3 l از نوكلئاز – آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز استفاده می شود .
دمای اپیتیم برای چسبیدن برای جفت پرایمروحالت چرخشی بااستفاده از یك mastercycler Gradient thermalcyler تعیین می گردد . تكثیر اولیه بوسیله 1 سیكل در دمای 94c برای 2 دقیقه انجام می شود وبعد با 30 سیكل دناتوره كردن در دمای 94cبرای یك دقیقه دنبال می شود وتواماُ چسبیدن وطولانی شدن در دمای 68c برای 1/5 دقیقه انجام می شود . محصولات اولیه تكثیر یافته از ویروس های رشد كرده برروی تخم مرغ به نسبت 1 در 10000 قبل از تكثیر ثانویه رقیق می كردند . یك مقدار از محصول اولیه (2 l) سپس به 48 l از مخلوط ثانویه pcr حاوی 5 lاز10 xpcr buffr (ph:8/4)tris-hcl ,200mm) و (kcl 500mm و 1 l از مخلوط داكسی نوكلئوزید تری فسفات و 1/5 l از 3 l , 50mm mgcl2 ازهر پرایمر داخلی در 25 pmol/ l (amp227f , amp 622r) و 34/2 l از نوكلئاز-آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز اضافه می كنیم . نمونه ها در دمای 94c برای 1 دقیقه انكوبیت می شوند وسپس برای 32 سیكل در معرض 94c به مدت 1 دقیقه و60c برای یك دقیقه و72c برای یك دقیقه قرار می گیرند .
Amplicon های (413bp) بوسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل رؤیت می شود و متعاقبأ برروی ژل آگارز2% الكتروفور می شود . جدول شماره 2

-تعیین حساسیت روش (I RT-PCR) تیتراسیون عفونت زایی ویروس :

روش های عفونت زایی همانطور كه قبلاُشرح داده شدبا تغییرات كوچكی انجام می گیرد . تعداد10رقت (10 -10)
از ویروسهای syd/97(h3n2) و DK/sing/97(h5n3) و HK/1073/99(h,n2) در محیط ترانسپورت ویروسی تهیه گردید . (vtm) ذمان انكوباسیون به 72 ساعت دریك انكوباتور co2 در 37c تغییر پیدا می كند . سلولهای كلیه سگ madin-darby بوسیله گلوتارآلدئید5% فیكس گردیدند وپلاكه بوسیله رنگ آمیزی با محلول كربول فوشین 5% vol/vol قابل رؤیت شدند .
RT-PCR(ii) : مقداری ازمحلول تازه وزنده ازهرویروس(100 l) حل شده در vtm در مجاورت عصاره نوكلئیك اسید و RT-PCR همانطوركه قبلاُشرح داده شد قرارداده می شود .

روش Heterduplex :

متدهای آنالیز hma كه قبلاُ شرح داده شد برای مطالعه گونه های مشابه ویروس نقص ایمنی انسان تیپ 1 آداپته شدند . برای hma ، 3 l از نمونه محصول pcr با 3 l ازمحصول pcrرفرنس و /3 l از بافر hmaحاوی1 m nacl و 100mm tris (ph:7/8)و 20mm edta مخلوط می گردد.
نمونه ها سپس در دمای 95cبرای 2 دقیقه دناتوره می شوند وسریعاُ تا دمای4c سرد می شوند . سپس برای 10 دقیقه برروی یخ گذارده می شوند .سپس بافر(1/3 l) gel loading اضافه می شود .
برم فنل بلو1% و glycerol و(g x ; tris-boric acid-edta{tbe} , 1% xylen cynol) نمونه ها برروی ژلهای پلی ساكاریدی غیر دناتوره 8% در(nove x TBE ) 1 x TBE برای 50 دقیقه در ولتاژ 200V الكتروفورز می شوند.همودوبلكس ها وهترودوبلكس ها بدنبال رنگ آمیزی ژل با sybr greenII قابل رؤیت می شوند.
تعیین توالی وبررسی فیلوژنیك : تعیین توالی نوكلئوتیدی amplicon های pcr m ژن بااستفاده از روش dye deoxy terminator انجام گرفت .
محصولات PCR m ژن بااستفاده از جفت پرایمر داخلی PCR amp227f و amp622r در 3/2 pmol/reaction تعیین توالی شدند. بررسی فیلوژنیك خوشاندی به دنبال تعیین توالی با استفاده از برنامه magaling4 انجام گرفت .

نتایج :

- تعیین میزان حساسیت و اختصاصی بودن RT-PCRبرای m ژن: حساسیت تشخیص ویروس آنفولانزایA بوسیله روش RT-PCR برای Mژن با استفاده از سه ساب تیپ ویروس آنفولانزایA به نامهایsyd/97(h3n2) و dk/sing/97(h5n3) و Hk/1073/99(h9n2) انجام گرفت . رقتهای سریال و متوالی از عصاره ویروسی تازه این ویروسها در vtm تهیه گردید. ازهررقتی، نوكلئتیك اسیدها برای سنتز cDNA و PCR جمع آوری شدند. به همین میزان نیز به ارزیابی عفونت زایی این روش ازهررقتی گرفته شد كه همان روز انجام گرفت در این الگو ، رقت نقطه پایان برای عفونت زایی ویروس می توانست مستقیماُ با نقطه پایان تشخیص RNA ویروسی بوسیله RT-PCR مقایسه گردد.
M ژن كه برای RT-PCR به كارمی رود 10pfu از ویروسهای آنفولانزایA (H9N2 , H5N3 , H3N2) درمیلی لیتر می باشد .این با حساسیت گزارش شده برای تشخیص ویروسهای آنفولانزایA وB بوسیله روش NESTED RT-PCR بااستفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای HAاز ویروسهای آنفولانزایA وB می باشد.RT-PCR برای میزان توانائیش در تشخیص ویروسهای آنفولانزایA از انواع حیوانات ومیزای اختصاصی بودنش برای ویروسهای آنفولانزایA مورد آزمایش قرار گرفت .
یك محصولی با اندازه ای كه انتظار می رفت (413bp) هنگامی كه ویروسهای آنفولانزای A مرغی ، انسانی یا خوكی آزمایش شدند بدست آمد . (جدول 1 و شكل 1)
این نتایج نشان می دهد كه توالی های mژن ویروسهای آنفولانزای A تمام حیوانات آزمایش شده را می توان با پرایمرهای لیست شده در جدول 2 تكثیر كرد .یكسری محصولات نامعلوم PCR هنگامی كه ویروسهای آنفولانزایB تست شدند مشاهده شدند ، كه دلالت بر اختصاصی بودن PCR برای توالی های ویروسهای آنفولانزای A می كند .
تعیین مشخصات آمپلیكونهای Mژن بوسیله HMA وتأئید توالی های آن :
بعد از تكثیر Mژن بوسیله RT-PCR اختصاصی بودن محصول PCR برای هرویروس بامنشأ میزبانی خاص بوسیله HMA مورد تحقیق وتخصص قرارگرفت . این كار با استفاده از بررسی طریقه فرم گرفتن هترودوبلكس بین آمپلیكونهای یك ویروس آنفولانزایA انسانی رفرنس (bay/95) وآمپلیكونهای ویروسهای مورد آزمایش از 15 ویروس آنفولانزای A مختلف از ساب تایپهای انسانی و خوكی ومرغی صورت گرفت . (جدول شماره یك ) (نتایج در شكل 2 نشان داده شده اند)
هترودوبلكس هایی كه بین آمپلیكونهای سویه رفرنس (BAY/95) ومحصول PCR هر ویروس مورد آزمایش مشاهده می شوند ، منعكس كنند تغییر توالی بین ویروس رفرنس وDNA ویروس مورد آزمایش می باشد .
هیچ هترودوبلكسی در ستونی كه حاوی فقط محصول PCR رفرنس می باشد مشاهده نمی شود .(lane 1,17) .كمترین كاهش در تغییر هترودوبلكس درجایی مشاهده می شود كه محصول ویروس رفرنس (bay/95) با آمپلیكون ویروس wuh/371/95 مخلوط گردیده است (lane 2) . هر دو ویروس bay/7/95 و wuh/371/95 از سویه های ویروس آنفولانزای انسانیA ،H1N1 می باشند .
بررسی توالی ها بر این امر دلالت می كند كه آمپلیكونهای Mژن ویروسbay/95 و wuh/371/95 تا 9/1% اختلاف دارند .(جدول 3)
بنابراین آمپلیكونهای با بیشتر از 2% variation درتوالی نوكلئوتیدی بوسیله این روش HMA می تواند متمایز گردد .
هیچ اصلاحی در دوباره حل شدن باند وقتی كه 10% ، 20% ، یا گرادیان ژلهای پلی آكریل آمید استفاده شد مشاهده نشد . بیشترین میزان كم شدن در تغیرپذیری در ستونی مه آمپلیكون رفرنس از bay/95 با محصولات pcr ویروسهایی كه دارای mژنهای ویروسی خوكی یا مرغی مخلوط شده اند مشاهده می گردد .(ستون 3 و4 و7 تا 16). اختلافات نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای pcr از این ویروسهای مرغی وخوكی وویروس رفرنس انسانی سویه bay/95 بوسیله بررسی توالی بین 5/14% و 4/21% مشاهده شد . میزان متوسط الگوی تغییر هترودوبلكس در مخلوطهای حاوی آمپلیكونهای pcrاز ویروسهای انسانی (bay/95) H1N1 وویروسهای انسانی H3N2 تست و syd/97 و wuh/359/95 مشاهده شد بررسی توالی ها یك اختلاف نوكلئوتیدی 7/6 تا 9/7 درصدی را بین ویروس H1N1 انسانی و آمپلیكونهای mژن ویروس انسانی H3N2 تست مشاهده شد .
ارزیابی یك الگوی رفرنسHMA برای تعیین انتقال بین گونه ها :

یك پانل از 9 و یروس آنفولانزای A با ژنهاب M كه در دودمان انسانی ، خوكی وطیور وجود دارند ساخته شد .
RNA از اینها و یك ویروس تست خالص سازی می شود (HK/1073/99) و RT-PCR روی آن انجام می گیرد .
آمپلیكونهای با اندازه ای كه اتنظار می رفت (314bp) بوسیله ژل آگاروز الكتروفورز قابل رؤیت می شود (شكل (A 3 یك قسمتی از هر آمپلیكون رفرنس برای hma با محصول pcr ویروس تست (HK/1073/99) مورد استفاده قرار گرفت . (نتایج در شكل 3B نشان داده شده است ). بیشترین كاهش در تغییر پذیری هترودوبلكس هنگامی مشاهده شد كه آمپلیكون HK/1073/99 با آمپلیكونهای ویروس انسانی رفرنس مخلوط گردید . (ستون 1 و 2)كه دلالت بر فاصله زیاد توالی Mژن ویروس مرغی با انسانی دارد . هترودوبلكسهایی كه هنگام مخلوط كردن محصول PCR ویروس HK/1073/99 با آمپلیكونهای رفرنس مشتق شده از ویروسهای خوكی و انسانی تشكیل شدند الگوهای تغییر پذیری گوناگونی را نشان دادند
بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی QU/HK/GI/97 H9N2 مشاهده شد (ستون7) . هیچگونه هتروبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 مخلوط شدند مشاهده نشد كه دلالت بر كم بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد. نتایجHMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمپلیكونهای PCR ، Mژن از 9ویروس رفرنس وویروس تست تأئید گردید. بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 بمیزان 1/1%می باشد .

- بحث :

بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی H9N2 Qa/HK/GI/97 , مشاهده شد « ستون 7» . هیچگونه هترو دوبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 مخلوط شده اند مشاهد نشد كه دلالت بر كم تر بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد . نتایج HMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمیلیكونهای PCR ، mژن از 9 ویروس رفرنس و ویروس تست تایید گردید . بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف توكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 به میزان 1/1% ازخوك یا طیور به انسان كم
می باشد اما چنین وقایعی می توانند منجر به میزان بالایی مرگ ومیر می شود واحتمال پدید آمدن ویروسهای جهانی را به دنبال دارد .

تشخیص زود هنگام وتعیین خصوصیت واریانت های جدید آنفولانزا كه پدید آمده اند یكی از اهداف شبكه جهانی حفاظت درمقابل آنفولانزا سازمان بهداشت جهانی می باشد .
از این رو ، دست یابی به تستهای سریع كه بتواند ویروسهای جدید و غیر معمول كه ممكن است دارای یك منشا به صورت مخزن حیوانی باشند ضروری است . متدهای سریع ، مانند ایمونوفلورسنس و enzyme immunoassay برای تشخیص ویروسهای آنفولانزا در نمونه های كلینیكی به كار رفته اند .

گزارش شده كه روش ها دارای اختصاصیت وحساسیت متغیری هستند و مشخص نیست كه چگونه معرفهای دخیل دارای توانایی معادل در تعیین ساب تایپهای ویروسهای آنفولانزای حیوانات مختلف هستند . ارزش روشهای PCR برای تشخیص ومحافظت ویروسهای آنفولانزا در مواد كلینیكی بخوبی نشان داده شده است . روشهای تكثیر برای تشخیص و ساب تایپ كردن ویروسهای آنفولانزای A وبرای تفریق ویروسهای آنفولانزای A,B,C شرح داده شده است . لیكن این روشها به طور اختصاصی برای تشخیص ، نگهداری ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده اند وبیشتر احتیاج است كه تستهای سریع جهت تشخیص ویروسهایی كه میزبان آنها موجوداتی غیر از انسان هستند طراحی گردند ، اخیراً یك RT-PCR تك لوله ای بر پایه m ژن برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A مربوط به چند گونه شرح داده شده است .
دراین مطالعه ما یك متد توأم PCR-HMA را برای شناسایی وتعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف طراحی كرده ایم .
ژنm1 بعنوان هدف انتخاب شد چراكه شواهد چنین پیشنهاد می كنند كه m1 ORF در میان ویروسهای آنفلولانزای A از گونه های مختلف میزبان به میزان زیادی حفاظت شده هستند. RT-PCR برای mژن نشان داده شده كه برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A ، 15 ساب تایپ مختلف با منشاء انسانی ، مرغی وخوكی اخصاصی وحساس می باشد . متدهای بعد از تكثیر برای بررسی تغییر توالی در آمپلیوكنهای PCR شامل بررسی RFLP ها و HAM ها می باشد.
ارز یابیRFLP ، محصولات m ژن PCR برای ساب تایپینگ ویروسهای آنفلانزای A انسانی و تفریق 6 ژن داخلی شامل m ژن ویروسهای انسانی H1N1,H3N2 , و ویروسهای مرغی H5N1 شرح داده شده است . اشكال احتمالی تكنیك RFLP این است كه موتاسیون در توالی نوكلئوتیدی آن مورد نظر ممكن است منجر به از دست دادن یا پدید آمدن باند شدن آنزیم محدود كننده شود . میزان بالای موتاسیون پذیری RNA ژنوم ها ، مانند ژنهای ویروس آنفولانزا احتمال رخ دادن این موتاسیونها را افزایش می دهد .
از آنجائیكه كه بررسی هترودوبلكس نشان داد كه برای تفریق سریع ویروسهای RNA دار بسیار مناسب می باشد وبدلیل اینكه سایتهای مناسب آنزیمهای محدود كننده كه ویروسهای انسانی ، مرغی وخوكی را متمایز می سازد در آمپلیكون 413 bp ژن m شناسایی شده اند ، HMA برای تعیین خصوصیات آمپلیكون m ژن انتخاب شد .
HMA بر مشاهده تغییرات توالی بین آمپلیكون های ویروس تست كه باعث پدید آمدن جفت نشدن درست با سویه رفرنس می شود ودر نتیجه هترودبلكس ها متعاقباً دناتوره می شوند ودوباره می چسبند استوار است .
هتروبكلس ها آهسته از همودوبلكس های هم اندازه خود مهاجرت می كنند وكاهش قابلیت حركت متناسب با میزان اختلاف بین دو توالی موجود درمخلوط دارد . درجه تغییر مورد نیاز برای تفریق مناسب هترودوبلكس ها نشان داده شده كه بین طیف 25 و 5% می باشد.

درجه اختلاف بین آمپلیكونهای m ژن مرغی ، خوكی ، و انسانی بینابین طیف می باشد و باعث تشكیل هترودولكس ها ی قابل تشخیص می شود . « جدول 3 »
شیفت در mobility هترودوبلكس مشاهده شد كه مرتبط با اختلاف بین DNA تست و رفرنس بود كه اختلافی به كمی 9/1 تا 1/1 % اختلاف توكلئوتیدی قابل تشخیص بود .

این موضوع با گزارشات قبلی تعیین اختلاف 4 تا 4/1 درصدی قابل قیاس بود . در این كار بهترین تمایز بوسیله HMA هنگامی مشاهده شد كه محصولات اولیه PCR قبل از تكثیر ثانویه رقیق شد .
از این موضوع می توان نتیجه گرفت كه هنگام آزمایش مستقیم نمونه های كلینیكی كه حاوی تیترهای پائین تری از ویروس نسبت به مواد رشد كرده بر روی تخم یا سلول هستند این كار ضروری نخواهد بود .
مناسب بودن متد PT-PCR HMA ما برای جستجوی نمونه های در یك شیوع بوسیله مقایسه یك تست ویروس با یك RAMEL ویروسهای رفرنس ارزیابی می گردد . سویه آنفولانزای مرغی H2N2 ( HK/1073/99 ) بعنوان ویروس تست انتخاب گردید چرا كه این ویروس مرغی از یك بچه 4 ساله درهنگ كنگ جدا شده است.
یك ارتباط عالی بین نتیجه HMA و اختلاف نوكلئوتیدی وجود دارد برای تشخیص بوسیله تعیین توالی مستقیم وبررسی پلی ژنتیك آمپلیکونهای ویروس تست و رفرنس .

بوسیله HMA، آمپلیكون PCR رفرنس مربوط به Qa/HK/GI/97 ارتباط دارد . این ارتباط بر اساس گزارشات قبلی با 1% اختلاف توكلئوتیدی بین m ژنهای HK/1073/99 , Qa/HK/GI/97 همراه می باشد . درمجموع ، نتایج كار ما نشان می دهد كه انجام توأم HMA,RT-PCR بر روی m ژن یك ابراز قوی برای تشخیص وشناخت ژنتیك ویروسهای آنفولانزا می باشد .HMA یك راه ساده وحساس برای جستجوی m ژنهای ویروس های آنفولانزای جدا شده می باشد وفقط 36 تا 24 ساعت وقت لازم دارد . اگر چه متد RT-PCR HMA برای بررسی نمونه های دستگاه تنفس در این مطالعه مورد استفاده قرار نگرفته ولی چنین نتیجه گیری می شود كه این متد می تواند بطور مستقیم برای تست ویروسها در نمونه های كلینیكی به كار رود بدون اینكه ضرورتی به رشد ویروس اول بر روی سلولهای محیط كشت یا جنین تخم مرغ باشد .

حساسیت روش m ژن RT-PCR كه شرح داده شد قابل قیاس با حساسیت روش RT-PCR كه در آن از پرایمرهای اختصاصی ژنهای HA ویروسهای آنفولانزای B,A برای تعیین ویروسهای آنفولانزای B,A به طور مستقیم درنمونه كلینیكی می شود می باشد . ویروسهای آنفولانزای جدید وغیر معمول را كه بوسیله HMA شناسایی شده اند می توان بسیار وسیعتر بوسیله تعیین توالی مستقیم و HI تایپینگ شناسایی وتعیین خصوصیت كرد . پانل HMA ویروس رفرنس را كه ماساختیم نیاز خواهد داشت كه با اطلاعات بدست آمده از ویروسهای كه در بین انواع حیوانات درچرخش است به روز شود . سرانجام ، تكنیك تركیبی RT-PCR هترودوبلكس می تواند برای شناسایی دیگر ژنهای داخلی ویروس آنفولانزا بكار رود .
بیماریزای عصبی ویروس آنفولانزای H5N1ژنوتیپ جدا شده از طیور هنگ كنگ در 2001 در موش

خلاصه :
ما پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ مختلف ( E تا A ) را از ویروسهای آنفولانزای مرغی H5N1 مطالعه كردیم كه حاوی ژنهای HA مشابه ویروس H5N1 A/goose /Guangdong/1/96 و 5 تركیب مختلف ژنهای داخلی در یك مدل موشی می باشد . واریانت های نوروتوپیك وبسیار پاتوژن ویروس از ژنوتایپهای A,C,D,E از مغز بعد از یك پاساژ داخل بینی در موش جدا شدند . ژنوتیپ ویروس B فقط از ششها جدا شدند .واریانت های مغز موش دارای آمینواسیدهای تغییر یافته در محصولات تمامی ژنهایشان بجز پروتئین های PB1,NP,NS1 بودند اما شامل موتاسیونهای معمول نبودند . ما نتیجه گرفتیم كه منشاء ژنوتیپی H5N1/01 از A,C,D,E بصورت هتروژنوس می باشد ودیگراینكه ورایانت های بسیار پاتوژن نوروتروپیك می توانند سریعاً در موش انتخاب شوند .