توليد داربست هاي پليمري : انجماد – خشك سازي

[javad jan]

توليد داربست هاي پليمري : انجماد – خشك سازي

PROCESSING OF POLYMER SCAFFOLD : FREEZE - DRYING
كيومين وانگ و كوين – اي – هيلي
پيشگفتار

داربست هاي پليمري بكار رفته به عنوان جانشين براي ماتريس برون سلولي ارثي (ECM)، براي بازسازي استخوان، غضروف، كبد، پوست و بافت‏هاي ديگر استفاده مي‌شود. پلي لاكتيد (PL)، پلي گليكوليد (PG) و كوپليمرهاي آنها (PLG) مواد مناسبي براي اعضاء جانشين به شمار مي روند، زيرا در هنگام كاشت در اثر هيدروليز بطور تصادفي تخريب شده و محصولات تخريبي آنها به شكل دي اكسيد كربن و آب كلاً از بدن خارج مي‌شود.
يك داربست ايده آل بايد داراي تخلخل مناسب براي انتشار مواد غذايي بوده و امكان پاكسازي مواد زائد را داشته و داراي پايداري مكانيكي مناسبي جهت تثبيت و انتقال بار باشد. علاوه بر اين، شيمي سطح ماده بايد چسبندگي سلول و علامت دهي داخل سلولي را به نحوي ارتقاء دهد كه سلول ها فنوتيپ طبيعي خودشان را بروز دهند. براي رشد سريع سلول، داربست بايد همچنين داراي ميكرو ساختار بهينه باشد (براي مثال، اندازه خلل و فرج، شكل، و مساحت ويژه سطح). اثر اندازه خلل و فرج كاشتن بر بازسازي بافت توسط آزمايشاتي كه نشان دهنده اندازه خلل و فرج بهينه براي فيبر وبلاست درون رست بين 20 و براي بازسازي پوست يك پستاندار بالغ و ​ بسته به مكانيزم، براي بازسازي استخوان است، مشخص مي‌شود. بدين ترتيب، هدف اصلي در ساخت داربست ها براي بازسازي بافت، كنترل دقيق اندازه خلل و فرج و تخلخل است.
داربست هاي پليمري زيست تخريب پذير ميكرو متخلخل توسط روش هاي متعددي كه شامل قالب گيري حلال(solvent casting)- فرو شستن (پالايش)ذرات(particle leaching)، تفكيك فازيphase separation))، تبخير حلال(solvent evaporation) و باند كردن فيبر(fiber bonding) براي شكل دهي شبكه پليمر هستند، آماده مي شوند. اين روشها به طور مفصل در فصل هاي ديگر آورده شده است. در اين فصل، قصد داريم يك شيوه پردازش جديد براي ساخت داربست‏هاي PLG بسيار متخلخل با مزاياي اضافي كه قابليت تلفيق رشد پايه پروتئيني و فاكتورهاي تفاضلي در زمان پردازش را دارند معرفي كنيم. اين شيوه خصوصاً ساخت دار بست هايي با تخلخل بيشتر از 90% و توانايي كنترل خلال و فرج هايي به اندازه 20 و را در بر مي‏گيرد.
اين روش پردازش شامل ايجاد يك امولسيون ازطريق هموژنيزه كردن (همگن سازي) محلول پليمر – حلال و آب، سرد كردن سريع امولسيون جهت حفظ ساختارحالت مايع و حذف حلال و آب در اثر انجماد و خشك سازي است.

[javad jan]

-موادMATERIALS پلي دي ال – لاكتيد /گليكوليد (PLG) نرح مولي 15 : 85 ؛ پليمرهاي بيرمينگهام،
بيرمينگام، AL (ايالت آلاباما)
كلريد متيلين (Mc)، تشخيص باكستر(baxter diagnostics)، مك گراپارك، IL (ايالت ايلينوي) آب فوق خالص: درجه
NaCl , Cacl₂ و آلبومين سرم گاوي (BSA)، سيگما – آلدريچ، سنت لوئيس، MO (ايالت ميسوري) پلي اتيلن گليكول (PEG)، شركت شيميايي فلوكا، رونكونكوما، NY (نيويورك)

[javad jan]

-تجهيزاتEQUIPMENT

هموژنايزر (همگن ساز)دستي، موسسه بين الملل امني، واتربري (ايالت كنتيكت) تخلخل سنج جيوه ران (MIP)، تخلخل سنج اسكن خودكار 33، موسسه (شركت) كوانتاكروم، سيوست، (نيويورك) NY
وجود يك دستگاه انجماد – خشك ساز اصلاح شده ضروري است زيرا دستگاههاي انجماد – خشك ساز تجاري قابليت انجماد – حشك سازي MC ياحفظ دمش خلاء از بخارات MC را ندارند.
اين سيستم از يك متراكم كننده (چگال ساز) (ويرتيس) -110c، متصل به يك تله نيتروژن مايع (ويرتيس، گاردينر، نيويورك)، متصل به يك پمپ خلاء مقاوم در برابر مواد شيميايي (BOC , RV12) محصولات خلا (كششي) ادواردز، ويلمينگتون، ايالت ماساچوست) كه قابليت كشش خلاء به درون سيستم را تا حدود motorr 20 دارند، تشكيل شده است.

[javad jan]

فرايند ساختFABRICATION PROCESS


نمودار فرآيند ساخت در شكل 1-60 نشان داده شده است. در ابتدا دو محلول مخلوط نشدني، فاز آلي و فاز آب را تشكيل مي دهند. فاز آلي توسط حل شدن PLG با ويسكوزيته ذاتي ويژه ​ در MC چنان انجام مي‌شود تا وزن در درصد حجم كل كل مطلوب امولسيون بدست آيد. فاكتورهاي زيست فعال هيدروفوبيكو عوامل فعال در سطح را نيز مي توان در اين فاز جهت تلفيق و ارائه و كنترل ميكرو ساختار داربست حل كرد. فاز آب، از آب فوق خالص به همراه يا بدون افزودني هاي حل شدني مختلف مانند فاكتورهاي زيست فعال هيدروفيليك براي تلفيق و ارائه ايجاد مي‌شود. براي نمونه نمك هاي CaCl₂ يا NaCl و يا عوامل فعال در سطح جهت كم به كنترل ميكرو ساختار بكاربرده ميشوند. فازهاي آب و آلي در يك لوله آزمايش شيشه اي كه 40% حجم آن آب است، به هم اضافه شده و دو لايه نامخلوط را شكل ميدهند. بر اساس مطالعات اوليه، اين درصد حجم آب پايدارترين وضخيم ترين امولسيون مناسب براي ساخت داربست‏ها را ايجاد مي كند.تركيبات ديگر منجر به ذوب شدگي و يا وارونگي فاز مي شوند (به عبارت ديگر شكل گيري ميكرو كره‏ها). اين لايه‏هاي نامخلوط به وسيله يك همگن ساز دستي كه در سرعت هاي مختلف تنظيم ميشود، همگن شده ودر يك قالب مناسب ريخته مي‌شود (براي مثال، شيشه يا مس). سپس با گذاشتن سريع قالب بر روي بلوك مس كه در كنار نيتروژن مايع با دماي (~ -196c) قرار دارد سرد مي‌شود. سپس نمونه ها در يكدستگاه انجماد –خشك ساز سفارشي motorr20 و دماي آغازين -110C منجمد و خشك مي شوند. بعد از اينكه دماي داخل امولسيون براي يك ساعت در 110c- به تعادل رسيد، دستگاه متراكم ساز خاموش شده و دستگاه متراكمساز و امولسيون به آرامي در طي 12 ساعت تا دماي اطاق گرم مي شوند. نمونه‏هاي بدست آمده در يك دستگاه خشك ساز خلاء در دماي اتاق براي ذخيره سازي وحذف بيشتر هر گونه حلال باقيماند قرارداده مي شوند. جهت كمينه سازي اتلاف پروتئين در طول فرايندساخت، يك شبكه نفوذي پلي اكريلاميد –كوپليمرشده با – اتيلن گليكول، با يك همگن ساز وماده شيشه اي پيوند زده مي‌شود تا رونشيني پروتئينadsorption)) از بين برود.

[javad jan]

- تشريح (توصيف) داربست هاCHARACTERIZATION OF SCAFFOLDS

ميكرو ساختار داربست ها را مي توان از نظر كيفي بوسيله ميكروسكوپي اسكن الكترون ولتاژپايين (SEM)(1.3KV) و از نظر كمي توسط روش تخلخل سنجي جيوه ران (MIP) براي تعيين متوسط خلل و فرج و تخلخل كه در جاهاي ديگر نيز گفته شده است، تحليل كرد. بطور كلي، كليه داربست هاي امولسيوني ساخته شده توسط روش انجماد – خشك سازي در محدوده درصد وزني PLG كه بطور خلاصه بيان شد و 40% حجمي آب، داراي تخلخلي بيشتر از 90% بوده و داراي مناطق سطح ويژه اي در حدود هستند. اين داربست ها داراي خلل و فرج هاي بسيار تو در تو با توزيع اندازه خلل و فرج بزرگ مي باشند. بزرگ ترين خلل و فرج ها، بيشتر از ​ هستند. البته، متوسط اندازه هاي خلل و فرج خاص با تغيير شرايط پردازش مشخص است.
داربست ها از طرفي كه امولسيون بعد از متخلخل شدن در قالب، در معرض محيط قرار مي گيرد، داراي پوسته غير متخلخل هستند. داربست هاي ضخيم، همگن،از نظر فيزيكي قابل كنترل، بدون حفره هاي فراوان (mm1> خلل و فرج‏هاي) به عنوان داربست هاي خوب شناخته مي شوند

[javad jan]

- متغير هاي پردازش تاثير گذار بر ميكرو ساختارداربست
processing variables affecting scaffold microarchitevcture

به غير از درصد حجم درحجم آب، اثرات كليد متغيرهاي ديگر نيزبركيفيت فيزيكي وميكرو ساختار داربست بررسي شدند. بدليل اينكه اين فرآيند، متغيرهاي فراواني را در بر مي گيرد، ارزيابي اثرات آنها با بكارگيري يك طرح آزمايشگاهي كه تمامي فاكتورها را درنظر گيرد به تعداد آزمايشات تقريبا بي شماري نيازخواهد داشت.
براي مثال، در يك فرآيند 4 متغيره، هر كدام با 3 حالت ممكن، حداقل تعداد آزمايشات براي ارزيابي متغيرهاي تاثير گذار بر ميكرو ساختار داربست برابر 81=3⁴ خواهد بود. براي كمينه كردن تعداد آزمايشاتي كه به آرايه هاي عمودي طراحي شده آماري نياز دارند، و براي تعيين مهم ترين متغيرهاي كنترل، تحليل آزمايشگاهي تاگوچي مورد استفاده قرار مي گيرد. متغيرهاي مورد بررسي شامل، غلظت plg وزن مولكولي plg، سرعت همگن سازي، تثبيت كننده‏هاي امولسيون اضافي وعوامل فعال در سطح مي شوند. جدول 1-60 حاوي چكيده اي از اثرات اين متغيرها بر ميكروساختار و كيفيت فيزيكي داربست است.

[javad jan]

-غلظت PLG PLG CONCENTRATION

تاثير سهم وزني پليمر (5 و w/v 10 پليمر) بر ميكروساختاروكيفيت فيزيكي داربست ارزيابي شده است. غلظت هاي پليمر بيشتر از w/v 10% براي ساخت داربست مناسب نيستند، زيرا ويسكوزيته بالاي فاز آلي از همگن سازي مناسب جلوگيري ميكند. نمونه هايي با w/v 5% PLG، ذوب شدگي قابل ملاحظه اي را از خود نشان دادند كه به ميكروساختار آسيب وارد مي كند، در حاليكه نمونه هاي با w/v 10% PLG داراي كيفيت فيزيكي بهتري بودند. لذا w/v5% PLG به عنوان متغير پردازشي زيست پذير در نظرگرفته نمي شود. ما همچنين مقدار مياني ​ را با موفقيت آزمايش كرديم.

[javad jan]

- وزن مولكولي PLG PLG MOLECULAR WEIGHT

اثر ‍PLG، 57/0 و ارزيابي شد. افزايش ‍PLG سبب بالا رفتن اندازه متوسط خلل و فرج و خصيصه هاي فيزيكي مي‌شود. اندازه متوسط خلل وفرج مستقيماً توسط ويسكوزيته محلول پليمر تاثير مي پذيرد.بنابراين نمونه هاي با بالاتر، ويسكوزتر (لزج تر) هستند. اين مشاهدات مي تواند بدليل دو فاكتور ذيل باشد : بر طبق قانون استوك، افزايش ​ نرخ خامه اي شدن را بوسيله افزايش چگالي محلول پليمر وويسكوزيته امولسيون كاهش مي دهد. و بر طبق عبارت استوك – انيشتين براي ضريب انتشار، افزايش ويسكوزيته محلول پليمر،نرخ كركينه سازي(flocculation rate) را كاهش مي دهد.

[javad jan]

-سرعت همگن سازيHOMOGENIZING SPEED



داربست هاي ساخته شده با سرعت هاي همگن سازي 5000 و rpm 17500 نشان مي دهند كه سرعت همگن سازي بالاتر منجر به بزرگ شدن اندازه متوسط خلل وفرج شده و خصوصيات فيزيكي را بهبود مي بخشد. اين وضعيت دور از ذهن است زيرا تئوري بيان مي كند كه افزايش نرخ برش سبب كاهش اندازه كروي فاز آب و در نتيجه اندازه خلل و فرج مي‌شود. البته افزايش نرخ برش حبابهاي هوا را در امولسيون القا كرده و بدين ترتيب سبب ايجاد داربست هايي با اندازه خلل و فرج هاي بزرگ مي‌شود. با وجود افزايش اندازه خلل و فرج، اين روش پردازش متغير بوده و كنترل آن دشوار است.در نرخ هاي برشي پايين تر، وجود حباب هاي هوا يك فاكتوربه حساب نمي آيد.

[javad jan]

- تثبيت كننده ها وعوامل فعال در سطح امولسيون
EMULSION STABILIZERS AND SURFACTANTS

اثرات تثبيت كننده ها و عوامل فعال در سطح امولسيون و غلظت آنها برميكرو معماري و كيفيت فيزيكي داربست بررسي شده اند. تثبيت كننده هاي امولسيون و غلظت هاي تست شده آنها عبارت بودند از: ​ اين. الكتروليت ها قبل از مرحله همگن سازي به فاز آب اضافه شدند. بر اساس تئوري درجا گوئين لانداو – فروي – اوربك (DLVO) متوجه مي شويم كه وجود غلظت الكتروليت هايي مانند CaCl₂ و NaCl مي تواند پايداري امولسيون هاي روغن درآب را با تاثير گذاري بر طول دبي بخاطر نيروي پس زني الكتريكي بين ذرات تغيير دهد.با وجود اينكه تئوريDLVO ناشي از ذرات كلوئيدي دريك محيط قطبي (به عبارت ديگر، امولسيون روغن درآب) است و امولسيون بكار رفته در اينجا بر عكس است، اما اين تئوري به همراه مفهوم افزايش نيروهاي پس زني و الكتريكي با حدود طولاني جهت افزايش پايداري امولسيون در اين كار بكار گرفته مي‌شود. غلظت هاي مختلف الكتروليت براي فشرده سازي ذرات براي افزايش تخلخل نهايي و اجازه ندادن به ادغام شدن (يكپارچه شدن)همزمان ( به عبارت ديگر شكست امولسيون) انتخاب شده اند.
افزايش غلظت NaCl يا CaCl₂ به پايداري سازي (تثبيت) امولسيون كمك كرده واجازه آرايش داربست هاي ضخيم با متوسط اندازه خلل و فرج كوچك تر را مي دهد. از آنجا كه الكتروليت ها در فاز (ناپيوسته) آب هستند، NaCl يا CaCl₂ ذرات سطح آب را باردار كرده و سبب افزايش نيروهاي پس زني الكترواستاتيك با حدود طولاني (بلند) در ميان حلال MC غير قطبي مي شوند. بدين ترتيب، بالا رفتن غلظت الكتروليت ظاهراً سبب افزايش نيروهاي پس زني الكترواستاتيك شده و با جلوگيري از تجمع و ادغام نهايي، طول دبي را نيز كه به تثبيت ذرات كوچكتر در امولسيون كمك مي كند، افزايش ميدهد.