توليد داربست هاي پيلمري:جداسازي فاز

[javad jan]

توليد داربست هاي پيلمري:جداسازي فاز
PROCESSING OF POLYMER SCAFFOLDS : PHASE SEPARATION
رويون ژانگ و پيتر – اكس – ما
اين فصل شامل روش هاي جديد آماده سازي داربست هاي پليمر زيست تخريب پذير مصنوعي ازمحلول هاي پليمر از طريق جداسازي فاز است. همچنين قراردادهاي مختلف ساخت داربست هاي بسيارمتخلخل مرتبط با فرآيندهاي مختلف جداسازي فاز را دربر مي گيرد. بلورينگي حلال در محلول پليمرموجب جداسازي فاز مايع – جامد مي گردد. اسفنج بدست آمده در اثر فرآيند جدا سازي فاز مايع – جامد داراي مورفولوژي لوله اي شكل ناهمگون با يك ساختار نردباني شكل داخلي است. اسفنج فوق با شبكه اي از خلل و فرج هاي پيوسته توسط القاي گرمايي جدا سازي فاز مايع – مايع ايجاد مي‌شود. ماتريس رشته اي مصنوعي با فيبرهايي با قطري به مقياس نانومتر توسط فرايند القاي گرمايي انعقادthermally induced gelation process)) تهيه مي شوند. ماتريس هاي نانو رشته اي با ساختار ماكرو متخلخل بوسيله تركيب روش پالايش پروژن و فرآيند القاي گرمايي ژلاتين بدست مي آيند. اسفنج هاي متخلخل پليمرهاي زيست تخريب پذير و آپاتيت هاي استخواني معدني شكل توسط فرآيند جدا سازي فاز مايع – جامد و فرآيند زيست تقليدي تهيه مي شوند.

[javad jan]

-پيشگفتار

مهندسي بافت يك روش نويد بخش را در توليد گزينه هاي بيولوژيكي براي كاشتني ها و پروتزها ارائه مي دهد. در اين روش وجود يك داربست بسيار متخلخل جهت استقرار سلولها و هدايت رشد آنها و بازسازي بافت در سه بعد الزامي است. پليمرهاي زيست تخريب پذير مصنوعي مانند پلي – ال – لاكتيد اسيد (PLLA)، پلي گليكوليك اسيد (PGA) و پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (PLGA) به طور گسترده به عنوان داربست هايي براي فراكاشت سلول و مهندسي بافت بكار برده مي شوند. روشهاي مختلفي براي تهيه داربست هاي بسيار متخلخل از اين پليمرهاي زيست تخريب پذير ارائه شده اند. پالايش ذره اي يك روش تاييد شده براي ساخت اسفنج هاي متخلخل در مهندسي بافت است. تكنولوژي‏هاي بافت به طور گسترده در ساخت چهار چوب‏هاي قابل بافت و غير قابل بافت زيست تخريب پذير براي مهندسي بافت بكار برده مي شوند.
براي ساخت داربست ها از روش خشك سازي امولسيون از طريق انجماد، اسفنج سازي گاز و چاپ سه بعدي بهره برده مي‌شود. امروزه روش جديد تهيه داربست هاي پليمري زيست تخريب پذير بسيار متخلخل يعني جدا سازي فاز القاي گرمايي محلول پليمر و انتقال (خارج سازي) بعدي، بسيار مورد توجه است.
فرآيند جداسازي فاز كنترل شده براي سالهاي متمادي براي تهيه غشاهاي متخلخل پليمر بكار برده مي‌شد.جدا سازي فاز محلول پليمر را مي توان به چندين روش ايجاد كرد، كه شامل جدا سازي فاز از طريق غير حلال، جدا سازي فاز از طريق شيميايي، و جدا سازي فاز از طريق گرمايي (TIPS) مي‌شود. در فرآيند TIPS كه يك روش نسبتاً جديد براي تهيه غشاهاي متخلخل است، دماي محلول پليمر كاهش يافته و جداسازي فاز رخ مي دهد كه فاز اول آن داراي غلظت پليمر بالا (فاز غني از پليمر) و فاز دوم داراي غلظت پليمر كم (فاز عادي از پليمر) است. بعد از خارج سازي حلال از طريق عصاره گيري، تبخير يا تصعيد، پليمر موجود در فاز غني از پليمر به شكل اسكلت سخت شده و فضاهاي اشغال شده در ابتدا توسط حلال، در فاز عادي از پليمر به صورت خلل و فرج اسفنج پليمر در مي آيند. موفولوژي غشاء متخلخل متناسب با پليمر، حلال، غلظت محلول پليمر و دماي جداسازي فاز، تغيير مي كند. غشاهاي بدست آمده از اين فرآيند معمولاً داراي خلل و فرجي با قطر چندين ميكرومتر بوده و معمولاً براي داربست‏هاي مهندسي بافت مناسب نيستند. يك داربست بايد داراي خلل و فرج هايي به اندازه كافي بزرگ براي كاشت سلول و سطحي به اندازه كافي وسيع براي چسبندگي سلول و همچنين افشانندگي(diffusivity) مناسب براي تراوش (نفوذ) مواد غذايي و متابوليت ها باشد. ما در اين فصل بر توسعه روش هاي جداسازي فاز القاي گرمايي براي ساخت داربست هايي با مورفولوژي و خصوصيات تخلخلي كنترل شده براي فراكاشت سلول و كاربردهاي مهندسي بافت تاكيد مي كنيم (شكل1-62). قراردادهاي توسعه يافته در آزمايشگاه ما به عنوان مثالهايي براي شرح اين مباحث بكار برده مي شوند.

[javad jan]

-موادmaterials

-پليمرهاpolymers
پلي – ال – لاكتيد اسيد (plla)، پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (15/85) (plga85) و پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (50:50) (plga50) با وسيكوزيته ذاتي در حدود 6/1 ، 4/1 و 5/0 از بهرينگر اينگلهايم (اينگلهايم، آلمان).
پلي دي، ال – لاكتيك اسيد – كو – گليكوليك اسيد (25 : 75) (plga75) و ويسكوزيته ذاتي 65/0-5/0 از موسسه بين المللي تكنولوژي هاي مديزورب (سينسيناتي، oh (ايالت اوهايو)
پلي دي ال – لاكتيد (pdlla) با وزن مولكول 103000 از شركت شيميايي سيگما (سنت لوئيس، mo (ايالت ميسوري))

[javad jan]

- حلال هاsolvents

ديوكسان، تتراهيدروفوران –n , n , (thf) دي متيل فور ماميد (dmf)، پريدين، متانول و بنزن از شركت شيميايي آلدريش (ميلواكي، wi (ايالت ويسكانسين) هيدروكسي آپاتيت ​ (hap)، و كليه نمك ها براي تهيه مايع شبيه سازي شده بدني (sbf) از آلدريچ.

[javad jan]

-جدا ساز فاز جامد – مايع solid-liquid phase separation

جداسازي فاز القاي گرمايي بر اساس رفتار جنبشي و ترموديناميك محلول پليمر با تغيير دماي محلول عمل كرده و يك فرآيند پيچيده است. بلورينگ حلال در زمان كاهش دما مي تواند موجب جداسازي فاز محلول پليمر شود. اين فرآيند جداسازي فاز را تحت عنوان فرآيند جداسازي فاز مايع- جامد تعريف مي كنيم. در اين حالت، دماي بلورينگي (نقطه انجماد) حلال بالاتر از دماي جداسازي فاز مايع – مايع محلول پليمر است. هنگامي كه دماي محلول كاهش مي يابد، حلال به شكل بلور درآمده و پليمر از سطح آن خارج مي‌شود كه همان جدا سازي فاز جامد – مايع محلول پليمر است. مورفولوژي بلورهاي حلال با حلال بكار رفته، غلظت پليمر و دماي بلورينگي وگراديان دماي اعمال شده به محلول پليمر تغيير مي كند. اسفنج‏هايي با مورفولوژي تخلخل متنوع به شل مدل‏هاي منفي بلورهاي حلال قابل حصول است.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي پليمريPREPARATION OF POLYMER MATRICES

اسفنج PLLA و PLGA از طريق جداسازي فاز مايع – جامد بوسيله كاهش دماي محلول پليمر و جهت ايجاد بلورينگي حلال و تصعيد متعاقب حلال تهيه مي‌شود. عموماً، در تهيه اسفنج مراحل ذيل طي مي‌شود. در ابتدا پليمر گزينش شده تحت چرخش مغناطيسي در دماي C50 به مدت 2 ساعت در حلال (اغلب، دي اكسين) حل مي شد. سپس ml2 محلول پليمر – دي اكسين به ظرف تفلون اضافه مي گردد (ml5، كه قبلاً تا دماي C50، گرم شده است) و حل مي‌شود.
ظرف حاوي محلول به سرعت به يخچال يا فريزر با دماي از پيش تنظيم شده منتقل مي‌شود تا حلال سخت شده و موجب جداسازي فاز مايع – جامد شود. تركيب سخت شده به مدت 2 ساعت سرد نگهداري شده و سپس به ظرف انجماد – خشك سازي، حمام نمك – يخ در دماي بين C5- و C10- منتقل مي‌شود. نمونه ها سپس از طريق انجماد mmHg5/0 براي حداقل يك هفته خشك مي شوند تا از حذف كامل حلال مطمئن شويم.

[javad jan]

اسفنج هاي بدست آمده از جداسازي فاز مايع – جامد محلول پليمر داراي مورفولوژي لوله اي بسيار ناهمگون، با ساختار داخلي نردباني شكل هستند (شكل 2-62). در اين روش، كانال ها موازي با جهت سخت شدن (جهت انتقال گرما) بوده و داراي بخش ‏هاي تكراري با فاصله هاي يكنواخت عمود بر جهت سخت شدن (استحكام) هستند. قطر كانال‏ها و فاصل بين بخش هاي تكراري در كانال با نرخ سرد شدن و غلظت پليمر و حلال مورد استفاده تغيير مي كند. براي يك سيستم حلال – پليمر، اندازه متوسط خلل و فرج با كاهش يافتن دما، زياد مي‌شود.
ساختار خلل و فرج بدست آمده از اين پردازش به بلورينگي حلال بستگي دارد. زماني كه دماي محلول پليمر كمتر از نقطه انجماد (دماي بلورينگي) حلال () باشد، حلال به شكل بلور در آمده و فاز پليمر به صورت ناخالصي از سطح بلورينگي خارج مي‌شود. فاز پيوسته غني از پليمر در اثر تجمع پليمر خارج شده از هر بلور منفرد حلال شكل مي گيرد. پس از تصعيد بلورهاي حلال، اسفنجي با مورفولوژي خلل و فرج هايي به شكل اثر انگشت بلورهاي حلال ايجاد مي‌شود. گراديان دما در امتداد مسير سخت شدن (استحكام) (از سطح نمونه تا مركز نمونه) مي تواند منجر به ساختار بسيار ناهمگون خلل و فرج شود.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي كامپوزيت پليمر-HAP
PREPARATION OF POLYMER – HAP COMPOSITE MATRICES
اسفنج هاي كامپوزيت پليمر وهيدروكسي اپتيت را مي توان با جداسازي فاز مايع – جامد تركيب حلال – پليمر- HAPو تصعيد متعاقب حلال توليد كرد. تركيب حلال – پليمر – HAP از طريق اضافه نمودن پودر HAP به محلول پليمر بدست آمده، تهيه مي‌شود. اين تركيب در طول شب در دماي اطاق چرخانده شده تا يك تركيب هموژن بدست آيد. سپس تركيب تا زمان القاي جداسازي فاز سردشده و حلال مانند فرايند ذكر شده براي ماتريس‏هاي پليمر تحت خلاء تصعيد مي‌شود. در اين روند، ml2 تركيب دي اكسين – PLLA-HAP بجاي محلول پليمر در ظرف تفلون بكار مي رود تا اسفنج كامپوزيت بدست آيد. تركيب نهايي اسفنج كامپوزيت HAP-PLLA بوسيله غلظت محلول پليمر و مقدار HAP در تركيب تعيين مي‌شود.
روش جدا سازي فاز مايع – جامد، يك ساختار پيوسته از خلل، فرج‏هاي نامنظم متصل به هم در اسفنج پليمر- HAP كه با اسفنج پليمري خالص بسيار تفاوت دارد ايجاد مي كند (شكل 3-62). اندازه خلل و فرج هاي نامنظم از چندين ميكرومتر تا حدود ​300 است. ديواره خلل و فرج ها از پليمر و HAP تشكيل شده است.

[javad jan]

ذرات hap افزوده شده به محلول پليمر، بلورينگي حلال را به هم زده و با تاخير انداختن در رشد بلور، بلورينگي حلال را تغيير مي دهد و در نتيجه منجر به شكل گيري بلورهاي نامنظم بيشتري مي‌شود. از طرف ديگر، هم ذرات hap و هم پليمر از سطح بلورينگي خارج شده و فاز غني از پليمر- hap را ايجاد مي كند. ذرات hap به طور تصادفي در ماتريس پليمر توزيع مي شوند. بعد از تصعيد حلال، فاز غني از پليمر- hap چارچوب پيوسته اسفنج پليمر – hap را تشكيل داده و فضاهاي اشغال شده اوليه توسط بلورهاي حلال بصورت خلل و فرج هاي اسفنج درمي آيند. در نتيجه رشد نامنظم بلور حلال، خلل و فرج هاي نامنظم موفولوژي غالب اسفنج كامپوزيت پليمر- hap را ايجاد مي كنند.
در فرآيند جداسازي فاز مايع – جامد، ميكروساختار اسفنج كامپوزيت را مي توان با تغيير غلظت پليمر، مقدار hap، دماي فرونشاني، پليمر، و حلال بكار رفته كنترل كرد. هم اندازه خلل و فرج و هم ميزان تخلخل با كاهش غلظت پليمر و مقدار hap افزايش مي يابد. همچنين، خصوصيات مكانيكي اسفنج هاي كامپوزيت بطور قابل ملاحظه اي نسبت به اسفنج هاي پليمري خالص بهبود مي يابد. كامپوزيت‏هاي حاوي hap، موادي با خصوصيات هدايت استخواني خوب بوده و داربست هاي مناسبي براي مهندسي بافت استخوان به شمار مي روند.

[javad jan]

- تهيه ماتريس هاي كامپوزيت پليمر آپاتيت توسط فرآيند زيست تقليدي
PREPARATION OF POLYMER-APATITE COMPOSITE MATRICES BY A BIOMIMETIC PROCESS
فرآيند زيست تقليدي جهت شكل دهي آپاتيت در اسفنج هاي پليمري بدست آمده از جداسازي فاز جامد- مايع بكار برده مي‌شود. اسفنج هاي پليمري توسط جدا سازي فاز جامد- مايع كه در ارتباط با ماتريس‏هاي پليمر تشريح شد، تهيه مي شوند. مايع شبيه سازي شده بدن (SBF) با حل كردن مواد شيميايي با درجه معرف
(Na₂So4, CaCl₂, MgCl₂ .6H₂O , K₂HPO₄. 3H₂O, KCl, NaHCo₃ ,NaCl) در آب يون زدايي شده تهيه مي شود، و غلظت هاي يون غير آلي آنها 5/1 برابر پلاسماي خون انسان است. اين مايع در PH برابر 4/7 در] با تريس (هيدرو كسي متيل) آمينومتان [] و اسيد هيدروكلريك (HCl) تثبيت مي‌شود. پنج گونه اسفنج پليمري مثلث شكل با ابعاد mm6*mm8*mm12 در ml100 SBF كه در يك بطري شيشه اي حفظ شده است، در دماي [] غوطه ور مي شوند. SBF هر يك روز در ميان عوض مي‌شود. بعد از نگهداري در مدت زمان هاي مختلف، گونه ها از مايع خارج شده و در طول يك شب در ml100 آب يون زدايي شده غوطه ور مي شوند تا يون‏هاي غير- آلي قابل حل خارج شوند، سپس در دماي اتاق خشك مي‌شود.






اسفنج كامپوزيت بدست آمده داراي تعداد زيادي ميكرو ذرات آپاتيت رشد يافته بر روي سطوح ديواره هاي خلل و فرج است (شكل 4-62). ذرات آپاتيت مشابه آپاتيت استخوان طبيعي در تركيبات و ساختارهاي تشريح شده با ميكروسكوپي اسكن الكتروني (SEM)، اسپكتروسكوپي تفرق انرژي (EDS)، انكسار اشعه X (XRD) و تحليل تبديل فوريه (FTIR) IR مي باشد. تعداد و اندازه ذرات با فاكتورهاي مختلفي مانند، زمان نگهداري، غلظت يوني SBF، ناحيه سطح پليمر و اصلاح سطح، كنترل مي شوند. چگالي (تعداد ذرات در واحد سطح)، قطر متوسط ذره و جرم كل آپاتيت با زمان نگهداري افزايش مي يابد. خصوصيات مكانيكي اين ماتريس كامپوزيت جديد بطور قابل ملاحظه اي نسبت به ماتريس پليمر خالص اصلاح شده و نيز با زمان نگهداري افزايش مي يابد. از آنجا كه ذرات آپاتيت بر روي ديواره هاي خلل و فرج تقليدي از استخوان معدني تشكيل مي شوند، انتظار بهبود هدايت استخواني مي رود.