توليد داربست هاي پيلمري:جداسازي فاز

[javad jan]

- تهيه ماتريس هاي كامپوزيت پليمر آپاتيت توسط فرآيند زيست تقليدي
PREPARATION OF POLYMER-APATITE COMPOSITE MATRICES BY A BIOMIMETIC PROCESS
فرآيند زيست تقليدي جهت شكل دهي آپاتيت در اسفنج هاي پليمري بدست آمده از جداسازي فاز جامد- مايع بكار برده مي‌شود. اسفنج هاي پليمري توسط جدا سازي فاز جامد- مايع كه در ارتباط با ماتريس‏هاي پليمر تشريح شد، تهيه مي شوند. مايع شبيه سازي شده بدن (SBF) با حل كردن مواد شيميايي با درجه معرف
(Na₂So4, CaCl₂, MgCl₂ .6H₂O , K₂HPO₄. 3H₂O, KCl, NaHCo₃ ,NaCl) در آب يون زدايي شده تهيه مي شود، و غلظت هاي يون غير آلي آنها 5/1 برابر پلاسماي خون انسان است. اين مايع در PH برابر 4/7 در با تريس (هيدرو كسي متيل) آمينومتان و اسيد هيدروكلريك (HCl) تثبيت مي‌شود. پنج گونه اسفنج پليمري مثلث شكل با ابعاد mm6*mm8*mm12 در ml100 SBF كه در يك بطري شيشه اي حفظ شده است، در دماي غوطه ور مي شوند. SBF هر يك روز در ميان عوض مي‌شود. بعد از نگهداري در مدت زمان هاي مختلف، گونه ها از مايع خارج شده و در طول يك شب در ml100 آب يون زدايي شده غوطه ور مي شوند تا يون‏هاي غير- آلي قابل حل خارج شوند، سپس در دماي اتاق خشك مي‌شود.






اسفنج كامپوزيت بدست آمده داراي تعداد زيادي ميكرو ذرات آپاتيت رشد يافته بر روي سطوح ديواره هاي خلل و فرج است (شكل 4-62). ذرات آپاتيت مشابه آپاتيت استخوان طبيعي در تركيبات و ساختارهاي تشريح شده با ميكروسكوپي اسكن الكتروني (SEM)، اسپكتروسكوپي تفرق انرژي (EDS)، انكسار اشعه X (XRD) و تحليل تبديل فوريه (FTIR) IR مي باشد. تعداد و اندازه ذرات با فاكتورهاي مختلفي مانند، زمان نگهداري، غلظت يوني SBF، ناحيه سطح پليمر و اصلاح سطح، كنترل مي شوند. چگالي (تعداد ذرات در واحد سطح)، قطر متوسط ذره و جرم كل آپاتيت با زمان نگهداري افزايش مي يابد. خصوصيات مكانيكي اين ماتريس كامپوزيت جديد بطور قابل ملاحظه اي نسبت به ماتريس پليمر خالص اصلاح شده و نيز با زمان نگهداري افزايش مي يابد. از آنجا كه ذرات آپاتيت بر روي ديواره هاي خلل و فرج تقليدي از استخوان معدني تشكيل مي شوند، انتظار بهبود هدايت استخواني مي رود.

[javad jan]

-جداسازي فاز مايع – مايعliquid – liquid phase separation زماني كه دماي بلورنيگي حلال بسيار كمتر از دماي جداسازي فاز محلول پليمر آمورف باشد، در اثر كاهش دماي محلول پليمر نسبت به بالاترين دماي بحراني محلول، تفكيك فاز مايع – مايع رخ مي دهد. شكل 5-62، نمودار يك فاز تعادلي معمولي سيستم محلول پليمر آمورف را نشان مي دهد. منحني اسپينودال منطقه تفكيك فاز مايع – مايع را به دو ناحيه ترموديناميكي فراپايدار(ناحيه بين بينودال اسپينودال) و ناحيه ترموديناميكي ناپايدار (ناحيه محدود شده توسط اسپينودال) تقسيم مي كند.
زماني كه يك محلول پليمر هموژن در اثر يكي از دو مكانيزم: هسته اي شدن و رويش يا تجزيه اسپينودال، تا دماي تركيب كمتر از دماي تجزيه بينودال سرد شود، نيرويي به وجود خواهد آمد كه منجر به تفكيك سيستم به دو فاز غني از پليمر و عاري از پليمر مي‌شود. در يك محلول پليمر با غلظت بسيار كم، زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه فرا پايدار قرار گيرد، آرايش ساختار ممكن حاوي قطرات فاز غني از پليمر پراكنده در ماتريس فاز عاري از پليمر مي‌شود. در اين حالت پس از خارج سازي حلال، پليمر جامد پودري شكل بدست مي آيد (شكل 1-62). زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه ناپايدار قرار گيرد، ساختار زيست پيوسته اي بدست مي آيد كه در آن فاز غني از پليمر و فاز عاري از پليمر كاملاً با هم پيوند خورده اند كه اين وضعيت در اثر تجزيه اسپينودال خواهد بود. اسفنجهاي با ساختار شبكه خلل و فرجي پيوسته، پس از حذف حلال از اين سيستم تفكيك فازي بدست مي آيند (شكل 1-62) زماني كه نقطه دماي تركيب زير ناحيه فرا پايدار محلول پرغلظت پليمر قرار گيرد، قطرات فاز عاري از پليمر در ماتريس فاز غني از پليمر شكل گرفته و اسفنجي با ساختار خلل و فرج بسته بدست مي آيد. (شكل 1-62)

[javad jan]

در يك محلول پليمر نيمه بلورين، تفكيك فازي به سبب بلورينگي پليمر بسيار پيچيده‏تر است. اگر دماي محلول پليمر به اندازه كافي پايين باشد، محلول دچار نيروهاي رانش براي تفكيك فاز مايع – مايع و بلورينگي پليمر شده و ساختار نهايي سيستم را تعيين مي‏كند بطور كلي، تفكيك فاز مايع – مايع سريعتر از بلورينگي پليمر اتفاق مي افتد. محلول در ابتدا تفكيك فاز مايع – مايع را تجربه كرده و سپس بلورينگي پليمر در فاز غني از پليمر رخ مي دهد كه مورفولوژي محلول تفكيك فاز اساساً به تفكيك فاز مايع مايع بستگي پيدا مي كند. در برخي موارد، محلول پليمر در خلال فرآيند سردسازي به شكل ژل در ميآيد. ژل شدگي فرآيندي است كه در آن كل محلول پليمر به شكل ژل كه شبكه اي از زنجيره هاي پليمري همبر(cross-linked) با حلال به دام افتاده در شبكه است سخت مي‌شود. در يك محلول پليمري نيمه بلورين، چفت شدگي توده هاي كوچك بلور، در شكل گيري ژل نقش كليدي بازي مي كنند. در اثر حذف حلال از ژل ساختار بسيار متخلخلي بدست مي آيد.
زماني كه دماي بلورينگي پليمر بالاتر از دماي اسپينو دال باشد، بلورينگي پليمر در محلول قبل از تفكيك فاز اسپينودال در طول فرآيند سردسازي رخ مي دهد. اگر محلول پليمر به اندازه كافي در دماي بالاتر از دماي اسپينودال نگهداري شود، محلول دچار تفكيك فاز القاي بلورينگي شده كه نوعي ديگر از تفكيك فاز مايع – جامد است. فاز غني از پليمر توسط هسته اي شدن و رويش بلورهاي پليمر ايجاد مي‌شود. پليمر پلاكت شكل در ماتريس فاز عاري از پليمر به حالت تعليق درامده و يا به سرعت د محلول ته نشين مي‌شود. زماني كه غلظت پليمر به اندازه كافي بالا باشد، عمل ژل شدگي نيز در فرآيند فاز تفكيك رخ مي دهد كه از آن مي توان براي ساخت اسفنج هاي پليمري استفاده كرد.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي پيوسته شبكه پليمر
PREPARATION OF CONTINOUS NETWORK POLYMER MATRICES
تفكيك فاز مايع – مايع القا شده گرمايي محلول پليمر را مي توان با انتخاب يك حلال با نقطه انجماد پايين تر از دماي تفكيك فاز محلول پليمر ايجاد كرد. براي پلي - هيدروكسيل اسيدها، تركيب دي اكسين و آب براي دستيابي به تفكيك فاز مايع – مايع بكاربرده مي‌شود. يك محلول پليمر صاف، (كه قبلا تا دماي 60C گرم شده باشد) تا دماي از قبل تعيين شده سرد گشته تا عمل تفكيك فاز مايع – مايع صورت گيرد. سپس محلول منجمد شده به داخل ظرف خشك سازي – انجماد، در دماي بين [- و 10C- در حمام يخ – نمك منتقل مي‌شود. بعد از خشك سازي از طريق انجماد براي يك هفته در mmHg5/0، حلال كاملاً خارج شده و اسفنجي متخلخل باقي مي ماند.





بسته به اينكه تفكيك فاز در كدام قسمت نمودار فاز دما – تركيب محلول پلير رخ دهد، از طريق تفكيك فاز مايع – مايع مي توان، هم ماده پودري شكل و هم اسفنجي با شبكه خلل و فرج پيوسته همگن بدست آورد (شكل 6-62). ساختار نهايي ماتريس حاصل از تفكيك فاز مايع – مايع به غلظت محلول پليمر، دماي فرونشاني (quenching temperature) و وزن مولكولي پليمر بستگي دارد. بطور كلي، ساختار پودر شكل از محلول پليمر با غلظت بسيار كم بدست مي آيد در حاليكه اسفنج با ساختار خلل و فرج همگن از محلول پليمري كه داراي غلظت نسبتا بالاتر است حاصل مي‌شود. در غلظت يكسان، پليمري كه داراي وزن مولكولي بالاتري است براي ايجاد آرايش ساختار يكنواخت خلل و فرج همگن مطلوب تر است. در يك محدوده غلظت مشخص پليمر، دماي فرونشاني كمتر (نرخ سرد سازي بالاتر) معمولاً منجر به ايجاد شبكه خلل و فرج در هم با اندازه خلل و فرج يكنواخت مي‌شود. دماي فرونشاني بالاتر (نرخ سرد سازي پايين تر) منجر به خلل و فرج هاي بزرگ تر با توزيع اندازه خلل و فرج وسيع تر مي گردد.
اندازه خلل و فرج اسفنج از تفكيك فاز مايع – مايع بدست آمده كه معمولاً از چندين ميكرومتر تا چند ده ميكرومتر است. فاز تفكيك شده غير دقيق (نامرغوب) در طول مراحل پاياني تفكيك فازي فاكتور ديگر است كه بر مورفولوژي فاز سيستم تاثير مي گذارد. زماني كه نمونه در دماي تفكيك فازي قرار مي گيرد، اندازه متوسط قطرات متناسب با كاهش تعداد قطرات در واحد حجم ميل به افزايش مي يابند، نيروي رانش براي چنين افزايشي در اندازه متوسط قطرات، تمايل سيستم در كمينه كردن انرژي آزاد بين سطحي يا به حداقل رساندن سطح درون لايه اي بين فازهاي غني از پليمر و عاري از پليمر است. اين پديده را مي توان براي كنترل اندازه خلل و فرج اسفنج هاي تهيه شده از تفكيك فاز مايع – مايع، بخصوص براي ساختارهاي متخلخل داربست هاي پليمري مهندسي بافت كه در آنها اندازه مناسب خلل و فرج براي كاشت سلول الزامي است بكار برد.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي پليمري با شبكه نانو رشته اي
PREPARATION OF POLYMER MATRICES WITH NANOFIBROUS NETWORK
براي تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي PLLA بسيار متخلخل از محلول PLLA القاء شده انعقاد گرمايي بايد سيستم حلال مناسب انتخاب شود. بطور كلي، مراحل پردازش عبارتند از:
1-محلول ml2 PLLA (كه قبلاً تا دماي C50 گرم شده باشد) به ظرف تفلون اضافه مي‌شود. ظرف حاوي محلول PLLA بلافاصله در يخچال يا فريزر با دماي از پيش تعيين شده براي ژل شدن قرار داده مي‌شود. سيستم هاي حلال مختلفي (از جمله THF ، DMF ، پيريدين، THF- متانول، دي اكسين – متانول، دي اكسين-H₂O ، دي اكسين – استون) براي تهيه ژل هاي پليمر بكار برده مي‌شود. زمان ژل سازي به دما، حلال و غلظت PLLA محلول بستگي دارد. بعد از ژل شدگي و قبل از شروع مرحله بعدي، ژل در دماي ژلاتيني براي 2 ساعت ديگر نگهداري مي‌شود.
2-ظرف حاوي ژل براي تعويض حلال در آب مقطر غوطه ور مي‌شود. آب سه بار در روز و به مدت 2 روز عوض مي گردد.
3-سپس ژل از آب خارج شده و توسط تكه كاغذ صافي پالايش مي‌شود و در دماي C20- به مدت 2 ساعت در فريزر قرار مي گيرد.
4-ژل منجمد شده را در ظرف خشك ساز – انجماد در دماي 5- تا C10- در حمام يخ –نمك قرارداده و سپس تحت خلاء (mmHg5/0(< براي يك هفته از طريق انجماد خشك مي كنيم.

[javad jan]

از طريق فرآيند ژل سازي، مي توان شبكه هاي سه بعدي نانو رشته اي را از محلول PLLA بدست آورد (شكل 7-62). شبكه رشته اي داراي رشته هايي (فيبرهايي) با قطر 50 تا mm500 است. آرايش شبكه اي رشته ها به دماي ژل سازي حلال محلول PLLA بستگي دارد. بطور كلي، در دماي ژل سازي پايين، ساختار نانو رشته اي، شكل مي گيرد. همچنين دماي ژل سازي براي ساختار رشته اي بستگي به حلال بكار رفته دارد. براي يك محلول PLLA-THF ، دماي ژل سازي براي تشكيل ساختار نانو رشته‏اي بايد كمتر از حدود C15 باشد. تخلخل ماتريس نانو رشته اي با افزايش غلظت پليمر كاهش مي يابد در حاليكه خصوصيات مكانيكي (از قبيل مدول يانگ و استحكام كششي) با غلظت پليمر افزايش مي يابد.
فرآيند ژل سازي ساخت ماتريس هاي رشته اي داراي مزاياي مختلفي است. كه از آنجمله عدم نياز به تجهيزات مي باشد كه بر عكس روش ساخت پارچه‏هاي غير بافتي با تكنولوژي نساجي است. اين فرآيند همچنين بسيار ساده تر است. ايجاد رشته هايي با قطر مشابه ماتريس هاي برون سلولي طبيعي با واحد نانومتر در تكنولوژي نساجي بسيار مشكل و يا حتي غيرممكن است. اين فرآيند را مي توان بوسيله قالب، مستقيماً براي ساخت داربست به شكل آناتومي قسمتي از بدن بكار برد. نرخ سطح به حجم در اين روش بسيار بالاتر از آن دسته پارچه هاي رشته اي غير بافتي تكنولوژي نساجي يا اسفنج هاي ساخته شده با روش هاي ديگر است.
هر چقدر كه مساحت سطح بالاتر باشد، چسبندگي سلول افزايش مي يابد. براي بسياري از انواع سلولها جابجايي سلول، رشد و عملكردهاي متمايز سلول، همگي بستگي به چسبندگي سلول دارند. بنابراين ماتريس هاي برون سلولي غير بافتي مصنوعي شرايط (محيط) بهتري براي چسبندگي، تكثير و عملكرد سلول فراهم مي كنند.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي پليمري با ساختار پلاكت شكل
preparation of polymer matrices with plateletlike structure
ماتريس plla بسيار متخلخل با ساختار پلاكت شكل از القاي گرمايي ژلاتيني محلول plla در دماي نسبتاً بالا تهيه مي شوند. همچنين حلال هاي بكار رفته در تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي را مي توان جهت ساخت ماتريس هايي با ساختار پلاكت شكل نيز بكار برد. فرآيند تهيه اسفنج ها با ساختار پلاكت شكل مشابه آن چيزي است كه در رابطه با شبكه هاي نانو رشته اي توصيف شده البته، دماي ژل سازي بايد متناسب با حلال بكار رفته، بالاتر باشد. براي يك محلول plla-thf، اسفنج هاي با ساختار پلاكت شكل در دماي ژل سازي بالاتر از c20 شكل مي گيرند (شكل 8-62). هسته سازي و رشد بلورهاي plla در دماي بالاتر از دماي تفكيك فاز اسپينودال مي توان سبب شكل گيري ساختار پلاكت شكل شود.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي نانو رشته اي با ساختار ماكرو متخلخل
PREPARATION OF NANOFIBROUS MATRICES WITH MACROPORE STRUCTURE
ماتريس رشته اي سه بعدي تهيه شده از ژلاتين محلول PLLA داراي خلل و فرج هايي با اندازه متوسط (فاصله بين رشته ها) چندين ميكرومتر هستند. البته، داربست هاي مهندسي بافت بايد داراي خلل و فرج هاي حداقل چند ده ميكرومتر باشند تا به خوبي دانه هاي سلول را در خود جاي دهند. براي بدست آوردن داربست هايي با ساختار نانو رشته اي و خلل و فرج هايي به اندازه كافي بزرگ براي كشت سلولي، تركيبي از روش‏هاي ژل سازي و پالايش پروژن بكار برده مي‌شود.
ذرات شكر به عنوان پروژن براي تهيه داربست هايي با ساختار نانو رشته اي و معماري ماكرو متخلخل به كار برده مي شوند. محلول پليمر از پيش گرم شده به آرامي بر روي ذرات شكر در قالب چكانده شده و سپس تا دماي ژلاتيني از پيش تعيين شده سرد مي‌شود. سپس كامپوزيت ژل – شكر در آب مقطر غوطه ور شده تا خروج حلال و پالايش شكر از كامپوزيت به طور همزمان انجام گيرد. ژل بعد از 4 روز از آب خارج شده و با كاغذ صافي پاك گرديده و به مدت 2 ساعت در دماي C20- در فريزر قرار داده مي‌شود. ژل منجمد شده در دماي 5- تا C10- در حمام يخ – نمك تحت خلاء (mmHg5/0<) براي يك هفته از طريق انجماد خشك مي‌شود. با تركيب روش ژل سازي و پالايش پروژن، يك ماتريس سه بعدي با معماري ماكرو متخلخل از كامپوزيت شكر – PLLA تهيه مي‌شود. (شكل 9-62).
برخلاف ديواره خلل و فرج اسفنج هاي تهيه شده با روش سنتي پالايش نمك، ديواره خلل وفرج ماتريس هاي جديد داراي شبكه نانو رشته اي است. ميكرو ساختار رشته اي به عنوان داربستي براي مهندسي بافت مي تواند چسبندگي سلول ها را افزايش داده و ساختمان ماكرو متخلخل آن، ساختار متخلخلي ايجاد مي كند كه براي توزيع فضايي سلول مطلوب است.

[javad jan]

-تهيه ماتريس هاي پيوسته شبكه پليمر
PREPARATION OF CONTINOUS NETWORK POLYMER MATRICES
تفكيك فاز مايع – مايع القا شده گرمايي محلول پليمر را مي توان با انتخاب يك حلال با نقطه انجماد پايين تر از دماي تفكيك فاز محلول پليمر ايجاد كرد. براي پلي - هيدروكسيل اسيدها، تركيب دي اكسين و آب براي دستيابي به تفكيك فاز مايع – مايع بكاربرده مي‌شود. يك محلول پليمر صاف، (كه قبلا تا دماي 60C گرم شده باشد) تا دماي از قبل تعيين شده سرد گشته تا عمل تفكيك فاز مايع – مايع صورت گيرد. سپس محلول منجمد شده به داخل ظرف خشك سازي – انجماد، در دماي بين 5C- و 10C- در حمام يخ – نمك منتقل مي‌شود. بعد از خشك سازي از طريق انجماد براي يك هفته در mmHg5/0، حلال كاملاً خارج شده و اسفنجي متخلخل باقي مي ماند.





بسته به اينكه تفكيك فاز در كدام قسمت نمودار فاز دما – تركيب محلول پلير رخ دهد، از طريق تفكيك فاز مايع – مايع مي توان، هم ماده پودري شكل و هم اسفنجي با شبكه خلل و فرج پيوسته همگن بدست آورد (شكل 6-62). ساختار نهايي ماتريس حاصل از تفكيك فاز مايع – مايع به غلظت محلول پليمر، دماي فرونشاني (quenching temperature) و وزن مولكولي پليمر بستگي دارد. بطور كلي، ساختار پودر شكل از محلول پليمر با غلظت بسيار كم بدست مي آيد در حاليكه اسفنج با ساختار خلل و فرج همگن از محلول پليمري كه داراي غلظت نسبتا بالاتر است حاصل مي‌شود. در غلظت يكسان، پليمري كه داراي وزن مولكولي بالاتري است براي ايجاد آرايش ساختار يكنواخت خلل و فرج همگن مطلوب تر است. در يك محدوده غلظت مشخص پليمر، دماي فرونشاني كمتر (نرخ سرد سازي بالاتر) معمولاً منجر به ايجاد شبكه خلل و فرج در هم با اندازه خلل و فرج يكنواخت مي‌شود. دماي فرونشاني بالاتر (نرخ سرد سازي پايين تر) منجر به خلل و فرج هاي بزرگ تر با توزيع اندازه خلل و فرج وسيع تر مي گردد.
اندازه خلل و فرج اسفنج از تفكيك فاز مايع – مايع بدست آمده كه معمولاً از چندين ميكرومتر تا چند ده ميكرومتر است. فاز تفكيك شده غير دقيق (نامرغوب) در طول مراحل پاياني تفكيك فازي فاكتور ديگر است كه بر مورفولوژي فاز سيستم تاثير مي گذارد. زماني كه نمونه در دماي تفكيك فازي قرار مي گيرد، اندازه متوسط قطرات متناسب با كاهش تعداد قطرات در واحد حجم ميل به افزايش مي يابند، نيروي رانش براي چنين افزايشي در اندازه متوسط قطرات، تمايل سيستم در كمينه كردن انرژي آزاد بين سطحي يا به حداقل رساندن سطح درون لايه اي بين فازهاي غني از پليمر و عاري از پليمر است. اين پديده را مي توان براي كنترل اندازه خلل و فرج اسفنج هاي تهيه شده از تفكيك فاز مايع – مايع، بخصوص براي ساختارهاي متخلخل داربست هاي پليمري مهندسي بافت كه در آنها اندازه مناسب خلل و فرج براي كاشت سلول الزامي است بكار برد.