ميكروسكوپ هاي آزمايشگاهي

ميكروسكوپ وسيله‌اي است كه براي بزرگ كردن تصوير اجسام كوچك و آشكار كردن جزئيات ساختارهايي كه با چشم غير مسلح قابل رويت نيست استفاده مي شود. اختراع اين وسيله انقلابي در علم زيست شناسي ايجاد كرد. ميكروسكوپ‌ها عمدتا در مراكز بهداشتي درماني براي آزمايشات، جراحي و تست هاي آزمايشي باليني به كار گرفته مي شوند.
طبق تكنيك استفاده شده براي بزرگنمايي نمونه و نوع كاربرد آن ميكروسكوپ هاي گوناگوني وجود دارد. سه نوع اصلي ميكروسكوپ هايي كه در پزشكي مورد استفاده قرار مي گيرند عبارتند از: 1) ميكروسكوپ هاي نوري، جهت استفاده آزمايشگاهي يا جراحي كه نمونه در مسير نور (ممكن است يك نور سفيد متشكل از تمام طول موج هاي مرئي، نور ماوراء بنفش يا بندرت نور مادون قرمز باشد) قرار مي گيرد 2) ميكروسكوپ الكتروني، كه براي روشن سازي و شكل گيري يك تصوير جهت نمايش در يك صفحه فلورسنت يا عكاسي، به جاي نور از الكترون استفاده مي كند و بدين ترتيب امكان بزرگ نمايي، تفكيك و رزولوشن بيشتري نسبت به ميكروسكوپ هاي نوري فراهم مي‌كند. اين نوع ميكروسكوپ براي مشاهده ساختارهاي سلولي و مولكولي بسيار مناسب است و 3) ميكروسكوپ هاي كاوشگر، كه منبع نور تكفامي را از يك ليزر استفاده شده ارسال مي كند. عملكرد ميكروسكوپ هاي ليزر-پويشگر بر حسب رزولوشن نوري، عمق كنتراست و حساسيت آشكارسازي نسبت به ميكروسكوپ هاي نوري متداول، بهتر گزارش شده است. تصاوير ميكروسكوپ هاي ليزر-پويشگر در مانيتورهاي ويديويي رزولوشن بالا نمايش داده مي شود.http://pnu-club.com/imported/mising.jpg
ميكروسكوپ نوري
اختراع اين وسيله ريزنما در حدود سال 1700 ميلادي توسط دانشمندي هلندي، آنتوان وان ليون هوك صورت گرفت. البته هيچ كدام از ميكروسكوپ هاي ساخت وي امروزه موجود نيست، چرا كه پس از مرگ او، دستگاه هاي او كه ساخته شده از طلا و نقره بودند توسط خانواده اش به فروش رفت. سال ها پس از اختراع ميكروسكوپ، از آن به عنوان وسيله اي تفريحي استفاده مي شد.
ميكروسكوپ هاي نوري امروزي نسبت به ساخته وان ليون هوك پيشرفت هاي بسياري كرده اند و بيشترين كاربرد آن ها در تحقيقات زيست شناسي و پزشكي است. اجزاي اصلي سازنده اين ميكروسكوپ ها عبارت از پايه، لوله ( تك چشمي monocular و دو چشمي )binocular، صفحه ميكروسكوپ و گيره هاي صفحه به عنوان بخش مكانيكي و عدسي ها (عدسي هاي شيئي و چشمي)، چشمه نور و كندانسور به عنوان بخش نوري هستند. كليه بخش ها روي پايه دستگاه كه معمولا وزن زيادي دارد سوار شده اند. عدسي هاي شيئي وظيفه تهيه تصوير بزرگ (و معكوس) از شيء مورد نظر را به عهده دارند كه اغلب به دو صورت خشك و روغني استفاده مي شوند. عدسي هاي چشمي عدسي هاي محدبي بوده كه تصاوير به دست آمده از عدسي هاي شيئي را بزرگ كرده و تصوير مجازي ايجاد مي كنند. چشمه نور كه نقش مهمي در تهيه تصوير مناسب دارد، در ميكروسكوپ هاي قديمي تر به صورت مجزا بوده، حال آنكه در ميكروسكوپ هاي مدرن چشمه نور در داخل دستگاه تعبيه شده است. چشمه نور در ميكروسكوپ مي تواند انواع مختلف لامپ باشد. در ميكروسكوپ هاي ارزان قيمت از لامپ تنگستن استفاده مي شود، لامپ هاي هالوژن كه متشكل از يك رشته تنگستن در گاز هالوژن است، از قيمت نسبت پاييني برخوردارند و نوري سفيد توليد مي كنند. از ديگر لامپ هاي مورد استفاده در ميكروسكوپ هاي نوري، لامپ هاي گزنون و جيوه اي هستند كه قيمت بيشتري دارند و از طريق تخليه الكتريكي كار مي كنند. پايداري لامپ هاي گزنون از لامپ هاي جيوه اي بيشتر است. كندانسورها نيز جهت متمركز كردن نور بر روي نمونه تعبيه شده اند و انواع مختلفي مانند كندانسور با عدسي متحرك، كندانسور آكرومات و ... دارند.
اساس كار ميكروسكوپ هاي نوري بدين ترتيب است كه جسم بين مركز و كانون عدسي شيئي كه عدسي محدبي است قرار مي گيرد، اين عدسي ها تصويري حقيقي، بزرگ تر و معكوس ايجاد مي كنند، حال اين تصوير حقيقي در فاصله كانوني عدسي محدب ديگري كه همان عدسي چشمي است قرار گرفته و تصويري مجازي، با بزرگنمايي چندين برابر بيشتر و مستقيم نسبت به شيي ايجاد مي شود. اين تصوير از داخل لوله ميكروسكوپ توسط چشم قابل مشاهده است.
نوعي از ميكروسكوپ هاي نوري، كه به ميكروسكوپ هاي درماتولوژي معروفند، براي ريزبيني سطح پوست استفاده مي شوند. اكثر اين ميكروسكوپ ها براي سنجش رنگ‌هاي مختلف و بررسي ضايعات پيگمان‌هاي پوستي استفاده مي شوند.
ميكروسكوپ هاي نوري آزمايشگاهي نيز انواع مختلفي دارند. يك نوع ميكروسكوپ نوري آزمايشگاهي زمينه روشن است. در اين ميكروسكوپ ها نور سفيد به صورت محوري به نمونه تابيده مي شود، بدين ترتيب نمونه در برابر يك زمينه روشن ظاهر مي شود. اكثر نمونه هاي ميكروسكوپي مقطعي نازك و رنگ آميزي شده هستند كه براي شناسايي جزئيات سطح و ساختار آن‌ها نياز به ميكروسكوپ هاي زمينه روشن داريم. اين ميكروسكوپ ها بسته به ميزان پيچيدگي در لابراتوارهاي آناليز ادرار، خون شناسي و تحقيقاتي مورد استفاده قرار مي گيرند. نوع ديگر ميكروسكوپ نوري آزمايشگاهي، ميكروسكوپ هاي زمينه تاريك هستند كه به صورت زاويه دار و كج به نمونه نور مي تابانند، ازاين‌رو نمونه در برابر زمينه اي تاريك، به صورت روشن ديده مي‌شود. تاژك ها، اسپيروكت ها، باكتري ها و نمونه هايي از اين قبيل با اين روش بسيار خوب ديده مي شوند. اكثر ميكروسكوپ هاي زمينه تاريك به صورت زمينه روشن نيز قابل استفاده هستند. اين ميكروسكوپ ها در ميكروب شناسي و سلول شناسي مورد استفاده قرار مي گيرد. دسته سوم از ميكروسكوپ هاي نوري آزمايشگاهي، ميكروسكوپ هاي نور قطبيده )Polarized Light( هستند كه نور قطبيده به دستيابي به كنتراست بالاتر و جزئيات واضح تر كه در روش هاي ديگر قابل رويت نيستند (به خصوص در نمونه هاي ناهمسانگرد و انكسار مضاعف) كمك مي كند. در نتيجه تداخل مخرب رنگ زمينه يا نتايج رنگي، مي توان اطلاعاتي از وضعيت و ساختار نمونه به دست آورد. بعضي از ميكروسكوپ هاي نور قطبيده را مي توان به صورت زمينه روشن نيز استفاده كرد. از اين ميكروسكوپ ها مي توان در زيست شناسي (قارچ هايي با انكسار مضاعف)، سلول شناسي (پايه خيس) و در آناليز ادرار (كريستال هاي انكسار مضاعف همچون اسيد اوريك) بهره جست. آخرين نوع از ميكروسكوپ هاي نوري آزمايشگاهي، ميكروسكوپ هاي تداخلي هستند كه تفاوت هاي مسير نور در نمونه را به اختلاف شدت در تصوير تبديل مي كنند. اين امر با تداخل بين نوري كه از ميان نمونه عبور مي كند و نوري كه مسير بدون مانع را دنبال مي كند امكان‌پذير مي شود. متداول ترين متد استفاده شده )DIC( قطبي كردن و شكافتن نور منبع به دو پرتو است. اين دو پرتو در مسيرهايي با اختلاف جزئي حركت كرده و از ميان نمونه عبور كرده و دوباره به هم مي‌پيوندند. سپس اختلاف مسير اين دو پرتو به صورت تفاوت در شدت و رنگ ديده مي‌شود. اين ميكروسكوپ ها با كنتراستي بسيار خوب براي نمونه هاي زنده يا بخش‌هاي رنگ نشده ظريف در باكتري شناسي، خونشناسي و سلول شناسي به كار گرفته مي‌شوند.
ميكروسكوپ هاي نوري با عملكردي مشابه اما شكل و ساختاري متفاوت تر (مثلا به صورت سقفي) در اتاق عمل جهت انجام جراحي هاي چشمي، اعصاب و جراحي‌هاي زنان مورد استفاده قرار مي گيرند. همچنين از ميكروسكوپ هاي نوري جهت معاينه در مواردي كه به درشت نمايي نياز است، مانند معاينات خاص چشم، پوست، گوش، حلق و بيني استفاده مي شود.
برخي ميكروسكوپ ها نيز قابليت اتصال به دوربين هاي تصوير برداري و سيستم هاي ويديويي را دارند تا بتوان نتايج را توسط مانيتور يا چاپگر ويديويي نمايش داد. اين سيستم ها معمولا متشكل از يك مبدل هستند كه براي اتصال يك دوربين ويديويي (معمولا )CCD به سيستم نوري ميكروسكوپ و پردازشگر تصوير استفاده مي‌شود. علاوه بر آن داراي مانيتور و سيستم ضبط كننده نيز هستند. اكثر اين نوع سيستم‌ها مجهز به تجهيزات اضافي جهت اندازه گيري و علامت گذاري تصاوير هستند. اين سيستم‌هاي ويديويي در پزشكي كاربردهايي نظير اندازه گيري سطوح متقاطع بافت ها و قطر رگ ها، همچنين در برخي اعمال تشخيصي و درماني دارد.
ميكروسكوپ هاي الكتروني
به منظور دستيابي به بزرگنمايي بيشتر، تحقيقات زيادي روي ميكروسكوپ ها انجام شد، كه نتيجه آن ها دستيابي به ميكروسكوپ‌هاي الكتروني بود. اولين ميكروسكوپ الكتروني در سال 1939 ميلادي ساخته شد. امروزه قوي ترين ميكروسكوپ الكتروني به نام پيكو در آلمان ساخته شده است كه توانايي تصوير برداري ذراتي به اندازه 50 پيكومتر را نيز دارد. ميكروسكوپ هاي الكتروني براي بزرگنمايي تصوير به جاي نور از پرتو الكتروني استفاده مي كند و نسبت به ميكروسكوپ هاي نوري، امكان بزرگنمايي بيشتر (نوعا 500000 برابر) و رزولوشن بهتر را فراهم مي كند. در اين ميكروسكوپ ها تصوير معمولا روي يك صفحه فلورسنت يا از طريق عكس برداري مشاهده مي شود. دو نوع بنيادي از ميكروسكوپ الكتروني وجود دارد:
SEM : ميكروسكوپ الكتروني روبشي كه با قابليت بزرگنمايي از 10 تا 100000 برابر و قدرت تفكيكي از 3 تا 100 نانومتر تصويري سه بعدي از سطح نمونه تهيه مي كند.
TEM : ميكروسكوپ الكتروني عبوري اساسا مانند يك ميكروسكوپ نوري كار مي كند اما از پرتو الكترون به جاي پرتو نور استفاده مي كند. اين ميكروسكوپ قابليت عكس‌برداري با بزرگنمايي 1000 تا 1000000 برابر و قدرت تفكيكي كوچك ‌تر از 1 نانومتر را دارد.
برخي ميكروسكوپ هاي الكتروني هردو تكنيك را تركيب مي كنند. TEM ها به منظور استفاده هاي باليني جهت مشخص كردن جزئيات بافت ها، سلول هاي تكي و ساختارها استفاده مي شود. SEM ها عمدتا براي اهداف پژوهشي و تحقيقاتي استفاده مي شوند و ندرتا كاربرد باليني دارند.
در ادامه به توضيح بيشتري درباره ميكروسكوپ هاي الكتروني مي پردازيم:
ميكروسكوپ الكتروني روبشي
نوعي از ميكروسكوپ هاي الكتروني كه به منظور مطالعه ساختار نمونه، براي نقشه برداري از سطح آن طراحي شده اند. ساخت اولين ميكروسكوپ روبشي به حدود سال 1940 بر‌مي‌گردد. SEM ها متشكل از يك لوله پرتاب الكترون و اتاق خلاء، يك سيستم تصوير برداري الكترومغناطيسي، يك سيستم روبشي، يك محفظه نمونه، آشكارسازهاي ثانويه و پس افشان، يك محفظه ديد، صفحه فلورسانت و سيستم هاي عكس برداري و وكيوم هستند.
سيستم تصوير برداري، يك باريكه الكترون با نقطه كانوني خوب ايجاد مي كند كه به صورت هاي افقي و عمودي منحرف مي شود (سيستم روبشي.) تبادل انرژي بين باريكه الكترون و نمونه، منجر به تشعشع الكترومغناطيسي مي شود كه با آشكارسازي آن تصوير به وجود مي آيد. قبل از مشاهده بايد نمونه ها پس از برش و پردازش و ثابت شدن (در برخي تجهيزات از cryofixation استفاده مي شود)، روي يك سطح حمايتي سوار مي‌‌شود و معمولا با يك فيلم نازك از فلزي سنگين (مانند طلا) پوشانده مي‌شود. كاربرد باليني SEM ها، دستيابي به اطلاعاتي در باره اختلالات هماتولوژيك و سطوح بيولوژيك مانند بخش هاي دروني و حفرات مايع كوچك است. اين ميكروسكوپ ها غير از علم پزشكي در متالوگرافي، بررسي مقاطع شكست و سنجش گراديان تركيب شيميايي روي نمونه هاي بسيار كوچك كاربرد گسترده اي دارند. البته كيفيت تصوير اين ميكروسكوپ ها در برخي موارد كمتر از ميكروسكوپ نوري است، كه گاهي محدوديت هايي نيز ايجاد كرده است.
ميكروسكوپ الكتروني عبوري
ميكروسكوپ هاي الكتروني هستند كه همانند ميكروسكوپ هاي نوري استفاده مي شوند با اين تفاوت كه آن ها براي بزرگ نمايي تصوير، به جاي نور از پرتو الكترون استفاده كرده و امكان بزرگ نمايي بيشتر و وضوحي بالاتر نسبت به ميكروسكوپ هاي نوري فراهم مي كند. تئوري ساخت اين ميكروسكوپ ها از سال 1932 مطرح شد. ميكروسكوپ الكتروني عبوري TEM( ها) از يك لوله پرتاب الكترون و اتاق خلاء، يك كندانسور الكترومغناطيسي، يك سيستم تصوير برداري الكترومغناطيسي، يك محفظه نمونه، يك محفظه ديد، صفحه فلورسانت و سيستم هاي عكس برداري و وكيوم تشكيل شده اند. قبل از مشاهده نمونه نيز مراحلي همانند آماده سازي نمونه در SEM ها روي آن انجام مي شود. TEM ها تصويري با جزئيات بسيار بالا (مثلا با بزرگ نمايي 500000 برابر) از بافت ها، سلول هاي تكي و ساختار سلول ها ايجاد مي كنند. اين ميكروسكوپ ها اكثرا براي شناسايي انواع ميكرو ارگانيسم ها (ويروس و باكتري) در نمونه هاي پزشكي (مثلا نمونه هاي بيوپسي) استفاده مي شوند.
ميكروسكوپ الكتروني روبشي/عبوري
ميكروسكوپي كه تركيبي از مشخصه هاي ميكروسكوپ هاي الكتروني روبشي و ميكروسكوپ الكتروني عبوري در يك دستگاه است. اجزاي سازنده اين ميكروسكوپ ها عبارتند از: يك لوله پرتاب الكترون و اتاق خلاء، يك كندانسور الكترومغناطيسي، يك سيستم تصوير برداري الكترومغناطيسي (مجموعه اي از عدسي ها)، يك محفظه نمونه، يك محفظه ديد، صفحه فلورسانت و سيستم هاي عكس برداري و وكيوم و يك سيستم روبشي. اقدامات آماده سازي نمونه نيز همانند ساير ميكروسكوپ‌هاي الكتروني است. كاربرد باليني اين ميكروسكوپ هاي الكتروني تركيبي، مشاهده ساختار بافت ها و سلول ها، تشخيص سلول‌هاي سرطاني، شناخت و تفكيك انواع بيماري هاي كليوي، و گردآوري اطلاعاتي در اختلالات هماتولوژيك و سطوح بيولوژيك است.
ميكروسكوپ هاي كاوشگر
از آنجا كه نمونه هاي زنده در خلاء و پرتوهاي الكتروني آسيب مي بينند، در علوم زيست شناسي، براي بررسي نمونه هاي زنده در شرايط شبه بيولوژيك از ميكروسكوپ‌هاي كاوشگر استفاده مي‌شود. همچنين براي استفاده از اين ميكروسكوپ ها نمونه نيازي به آماده سازي ندارد و مي توان بدون آماده سازي يا با كمترين آماده سازي آن را مورد آناليز قرار داد. علاوه بر آن، اين ميكروسكوپ ها جهت تصوير برداري در علم مواد كاربرد زيادي دارند. ميكروسكوپ هاي كاوشگر انواع مختلفي چون ميكروسكوپ تونلي، ميكروسكوپ نيروي اتمي، ميكروسكوپ نيروي مغناطيسي و ميكروسكوپ نيروي جانبي دارند.