متعادل سازي بعدهاي الكتروفورز

متعادل سازي بعدهاي الكتروفورز
مقدار اضافه کردن نمونه

براي بدست آوردن بهترين قدرت تفكيك, بيشترين تعداد نقاط و كمترين رگه ها درژل, مقدار پروتئيني كه بر روي يك نوار "IPG" اضافه مي شود از اهميت زيادي برخوردار است. مناسب ترين مقدار نمونه اي که به نوار "IPG" اضافه مي شود با در نظر گرفتن عواملي نظير هدف مورد نظر, طول نوار يا فاصله جداسازي, ماهيت و تعداد پروتئين هاي موجود در نمونه, شيب ‍pH ، و نيز روش رنگ آميزي مورد نظر, انتخاب مي شود.

براي مثال در صورتيکه نمونه اي حاوي مخلوط پيچيده اي از پروتئين ها باشد, بايد بر اساس هدف تجربه, مقدار اضافه کردن را انتخاب کرد؛ اگر هدف بررسي پروتئين هايي با فراواني کم باشد, بالطبع بايد مقدار نمونه بيشتري را اضافه نمود. در صورتيکه هدف بدست آوردن يک ژل زيبا و تميز براي درج در مقاله يا ارائه به صورت تصويري باشد, نشان دادن پروتئين هايي با فراواني بيشتر و اجتناب از ظهور رگه ها از اهميت بيشتري برخوردار خواهد بود, در نتيجه مي توان مقادير کمتري از نمونه را به نوار "IPG" اضافه نمود. يا در زمانيکه از نوارهايي با محدوده ي pH کوچک استفاده مي شود, مي توان مقادير بيشتري از نمونه را به کار برد چرا که بعد از "IEF" فقط پروتئين هايي با pI داخل اين محدوده در نوار باقي ميمانند و در بعد دوم ظاهر مي شوند.

به هر حال, ميزان نمونه اي که اضافه شود مي توانــد از چنــدين ميکروگرم تا چند ميــلي گرم متغيــر باشــد.

اگر غلظت پروتئيني نمونه ناشناخته باشد, براي دستيابي به تخميني حدودي و سريع از غلظت نمونه, مي شود با تهيه رقت هاي متوالي از نمونه و نيز از يك محلول پروتئيني استاندارد با غلظت مشخص, آنها را روي غشا نيتروسلولز نقطه گذاري كرد و بعد با آمينوبلك يا كوماسي بلو رنگ آميزي كرد. مقايسه شدت رنگ رقت هاي استاندارد با نمونه, محک قابل قبولي براي تخمين حدودي از غلظت نمونه خواهد بود.

درعمل بهترين زمان فوكوسينگ موردنياز براي رسيدن به بهترين كيفيت و تكرارپذيري, زماني است كه تمام پروتئين هاي داخل نمونه در pI خود متمرکز شده باشند. در "IEF" معمولا" واحد ساعت ولت که حاصل ضرب ولتاژ اعمال شده در زمان بر حسب ساعت است, مورد استفاده قرار مي گيرد. اگر ساعت ولت "IEF" به اندازة كافي نباشد, معمولاً رگه هاي افقي در نمايه ي دو بعدي ظاهر مي شوند. از طرف ديگر بايد از فوكوس شدن بيش از حد نيزخودداري شود, چرا که در "IPG", برخلاف متد كلاسيك "O’Farell", فوكوسينگ بيش از حد منجر به مهاجرت پروتئينها به سمت كاتد نمي شود, بلکه اين امر منجر به تراوش بيش از حد آب درسطح ژلهاي IPG ناشي از انتقال فعال آب مي شود كه به اين پديده جريان الكترواندوسموتيك معكوس مي گويند. در نتيجه نمايه واقعي ژل تخريب و دستخوش تغيير مي گردد, رگه هاي افقي در انتهاي بازي ژل پديدار شده و احتمالاً برخي از پروتئينها نيز از دست مي روند. براي حل اين مشكل علاوه بر کاهش زمان فوکوسينگ بايد حتما" سطح "IPG" در حين فوکوسينگ از روغن معدني پوشيده باشد.

به هر حال زمان فوكوسينگ بهينه بصورت تجربي براي هر نمونه ي پروتئيني و با در نظر گرفتن ميزان پروتئين اضافه شده, محدودة pH بكار گرفته شده و حتي طول انتخاب شده براي نوارهاي "IPG", تعيين مي شود.
4-6- انتخاب شيب pH براي ايزوالكتروفوكوسينگ با IPG

معمولاً براي آناليز اوليه ي يك نمونه ي جديد از شيب pH با محدوده ي وسيع،10-3، استفاده مي شود. در بسياري از نمونه ها استفاده از شيب pH 10-3 باعث از دست دادن قدرت تفكيك در محدوده ي pH 7-4 مي شود، محدوده اي که نقطة ايزوالكتريك بسياري از پروتئينها در آن قرار دارد. براي غلبه نسبي بر اين مشكل استفاده از "IPG" با شيب pH غيرخطي 10-3 توصيه مي شود .كه در آن ناحيه ي pH 7-4 داراي شيب کمتري در مقايسه با شيب ناحيه ي 10-7 است. با اين کار نه تنها جداسازي خوبي در ناحية pH 7-4 خواهيم داشت, بلکه اغلب پروتئين هاي بازي نيز به خوبي از همديگر تفكيك مي شوند. استفاده از نوار "IPG" با شيب pH 7-4 حتي منجر به جداسازي بهتر پروتئين ها در اين ناحيه مي شود. نوارهاي "IPG" تجاري براي اين محدوده هاي pH قابل خريداري هستند. البته مي توان از "IPG" هاي دست ساز در آزمايشگاه نيز استفاده كرد كه بيشتر پروتئينهاي سلولي را براي بسياري از انواع نمونه ها تحت پوشش قرار دهد.

در نمونه هاي پيچيده نظير نمونه هايي كه از سلولهاي اوكاريوتيك گرفته مي شوند، انجام الكتروفورز دوبعدي بر روي يك شيب pH با محدودة گسترده, فقط درصد كمي از كل پروتئوم را نشان مي دهد چراكه قدرت تفكيك فضايي ناكافي است و همين مسئله نمايان سازي پروتئينهايي كه داراي نسخه هاي كمتري هستند را درحضور گونه هايي که فراواني بيشتري دارند، با مشكل مواجه مي کند. يك راه براي غلبه بر مشكل محدودة ديناميك بالا و گوناگوني پروتئينهايي که در بافتهاي اوكاريوتيك بيان مي شوند از پيش جز به جز کردن نمونه ها است. راه بسيار موثر ديگر استفاده از چندين نوار "IPG" با محدوده هاي کوچک(واحد pH 5/1-1) است، به طوري كه اين محدوده ها همديگر را بپوشانند. اين روش به ژلهاي درشتنما Zoom Gels يا ژلهاي كامپوزيت يا ژلهاي ساب پروتئوميكس موسوم است. در نهايت افزودن فاصله جداسازي تا 24 سانتيمتر هم مي تواند براي حل مشکل فوق مورد استفاده واقع شود.

"IPG" هاي با محدوده هاي کوچک و نيز"IPG" با pH 7-4 با هر دو شيوة بارگيري نمونه توسط پياله هاي بارگيري و نيز بارگيري در حين خيساندن ژل سازگار هستند. اين ژلها براي نمونه هايي با غلظت در حد ميکرو ايده آل هستند, اما نياز به افزايش زمان فوكوسينگ دارند.

نمايه هاي دوبعدي مجازي كه از روي توالي هاي ژنومي محاسبه شده‌اند، نه تنها نشان مي دهند كه اغلب پروتئينهاي يك سلول ليزشده داراي pI بين pH 9-4 هستند، بلكه بيانگر اين نکته اند كه تعداد قابل توجهي از پروتئينها با pI بالاتر از pH 12 نيز وجود دارند. مثلا" پروتئينهاي نوكلئار يا ريبوزومي پروتئينهاي شديدا" بازي با pI نزديك به هم هستند,. اين پروتئين ها با استفاده از IPG هاي با محدودة كوچك pH: 12-10يا pH 12-9 قابل جدا شدن هستند. در الكتروفورز دوبعدي كلاسيك که از آمفولايت استفاده مي شد, پروتئينهاي بازي فقط توسط "NEPHGE" از همديگر جدا مي شدند، اما اينک به راحتي با استفاده از "IPG IEF" جداسازي مي شوند. براي اين منظور استفاده از محدوده ي کوچک pH 12-10 يا pH 12-9 توصيه مي شود.

براي بدست آوردن تكرارپذيري بالا در الکتروفورز دوبعدي, مراحل بهينه سازي مختلفي با توجه به pH و تركيب ژل مورد استفاده قرار مي گيرند. براي مثال در زمان استفاده از "IPG" هاي بازي به منظور جلوگيري از ظهور رگه هاي افقي متعدد در نمايه ي ژل دو بعدي, که ناشي از جريان الكترواندوسموتيك معكوس است، مي توان از يك كاغذ ----- اضافي كه در "DTT" غوطه ور شده بر روي سطح نوار "IPG" درطول الكترود كاتدي استفاده کرد. "DTT" آزاد شده از اين نقطه بر روي نوار, جايگزين "DTT" موجود در ژل مي شود كه به سمت آند در حين IEF مهاجرت مي كند و خارج مي شود. راه حل ديگر براي ممانعت از ايجاد رگه هاي افقي استفاده كردن از "TBP" است. اين عامل احياء كننده ي بدون بار الكتريكي, درحين ايزوالكتروفكوسينگ به سمت آند مهاجرت نمي كند. ديگر روشهاي مقابله با اين مشکل استفاده کردن از اِن، اِن دي متيل آکريل آميد به جاي آكريل آميد , اضافه کردن ايزوپروپانل به محلول مخصوص خيساندن "IPG"، همچنين بارگيري نمونه در آنود توسط پياله بارگيري، و استفاده از روغن معدني براي پوشاندن نوارهاي "IPG" در زمان ايزوالکتروفوکوسينگ است.
4-7- متعادل سازي بين بعدهاي الكتروفورز:

بعد از "IEF" نوارهاي "IPG" را مي توان فوراً به بعد دوم انتقال داد. در عين حال مي توان اين نوارها را بين دو ورقة پلاستيكي و در80- درجه سانتي گراد به مدت چندين ماه نگهداري كرد. قبل از جداسازي دربعد دوم بايد ژلهاي الكتروفوكوس شده متعادل شوند. اين کار براي ورود "SDS" به ژل و واكنش كامل پروتئين ها با "SDS" صورت مي گيرد به طوري که مهاجرت پروتئين ها از "IPG" به "SDS-PAGE" امکان پذير گردد.

براي اين كار نوارهاي ژل "IEF" به مدت 15 دقيقه در بافر تريس 50 ميلي مولار که حاوي 2% "SDS" ، 1% "DTT", 6 مولار اوره و 30% گليسرول است, قرار داده مي شوند. اوره و گليسرول براي كاهش اثرات الكترواندوسموتيك بكار برده مي شوند كه عدم بكار بردن آنها منجر به كاهش انتقال پروتئين از بعد اول خواهد شد. پس از اين كار, متعادل سازي 15 دقيقه ي ديگر در محلولي مشابه كه حاوي 5% آيودواستامايد به جاي "DTT" است, ادمه مي يابد . اين مرحله براي آلكيله كردن گروه هاي SH در پروتئين هاي محلول و ممانعت از ايجاد پيوندهاي دي سولفيدي بين آنها در حين الکتروفورز صورت مي پذيرد. مقدار اضافي آيودواستامايد نيز در آلکيله کردن "DTT" هاي آزاد مصرف مي شود. در صورت حضور"DTT" هاي آزاد در نوار ژل, آنها در طي بعد دوم داخل ژلهاي "SDS-PAGE" مهاجرت مي كنند و منجر به ايجاد آلودگيهايي مي شوند كه به عنوان رگه هاي نقطه اي شناخته شده اند و پس از رنگ آميزي با نيترات نقره قابل مشاهده هستند (شکل 4-7) .

روش جايگزين ، انجام متعادل سازي در يك مرحله است كه در آن "DTT" موجود در بافر متعادل سازي با 5 ميلي مولار "TBP" جايگزين مي شود, چون "TBP" داراي بار الكتريكي نيست و در طي "SDS-PAGE" نيز مهاجرت نمي كند.

نوارهاي "IPG" پس از متعادل سازي بايد کاملا" خشك شوند, يعني گوشة آنها بر روي كاغذ ----- به مدت 1 دقيقه نگه داشته مي شود تا قبل از اينكه به بعد دوم بروند, مايع اضافي از آنها گرفته شود.

نکته قابل توجه اين است که با استفاده از روش رايج متعادل سازي, يعني استفاده از "DTT" و آيودواستامايد, ممکن است دو نوع مشتق آلکيله از سيستئين به وجود آيد, يکي کربوکسي آميدو متيل – سيستئين ناشي از عملکرد آيودواستامايد در حين متعادل سازي و ديگري سيستئين – پروپيونامايد ناشي از واکنش با آکريل آميد مونومر باقي مانده در ژل " . SDS-PAGE" درحين بعد دوم. در صورت استفاده از آکريل آميد براي آلکيلاسيون, تنها يک مشتق آلکيله از سيستئين (سيستئين پروپيوناميد) در الکتروفورز دو بعدي به وجود خواهد آمد. اين مسئله به عنوان يک مزيت در تعيين هويت با طيف سنجي جرمي تلقي مي گردد, چرا که با حذف امکان ايجاد مشتق هاي آلکيله متفاوت از سيستئين در يک پروتئين, از سردرگمي در حين تعيين هويت ممانعت به عمل مي آورد