ايزوالکتروفوکوسينگ "IEF" روش الکتروفورزي است که درآن پروتئين ها بر اساس نقطه ي ايزو الکتريک pI خود و با استفاده از ژل پلي آکريل آميدي که داراي شيب pH و حاوي غلظت زياد اوره است, از يکديگر جدا مي شوند. بنابر اين در اين نوع از الکتروفورز, پروتئين ها بر اساس بار الکتريکي, که يک خصوصيت ذاتي و وابسته به ساختار اسيد آمينه هايشان است, از يکديگر جدا مي شوند.
در اين فصل به اصول جداسازي توسط "IEF", روشهاي مورد استفاده و نکات مهمي که در حين انجام اين فن بايد در نظر گرفته شوند, مي پردازيم.
4-1- مباني نظري ايزوالکتروفوکوسينگ
بار الکتريکي خالص (Net charge) پروتئين ها يک ويژگي ذاتي و ناشي از ساختار اسيد هاي آمينه آنها است. پروتئين ها مولکولهايي آمفوتر هستند, يعني بسته به pH محيطي که در آن قرار می گيرند داراي بار الکتريکي خالص مثبت, منفي ويا خنثي مي شوند. نوع, تعداد و توالي اسيدهاي آمينه ي سازنده ي پروتئين, بار الكتريكي خالص آن را تعيين مي کند. در واقع بار الکتريکي خالص يک پروتئين, جمع جبري تمام بار هاي مثبت ومنفي زنجيره هاي جانبي اسيدهاي آمينه ي تشکيل دهنده ی آن و دو انتهاي آميني و کروبکسيلي اش است. به خصوص اسيدهاي آمينه ای كه داراي زنجيره هاي جانبي قابل يونيزه شدن هستند, نقش موثرتري در اين مسئله دارند. با توجه به اين نکته که واكنشهاي يونشي گروه هاي جانبي اسيدهاي آمينه برگشت پذيرند, تاثير pH محيط در بار اکتريکي آنها کاملا" قابل انتظار است. براي مثال اسيد آمينه بازي مثل هيستدين كه داراي گروه ايميدازول است, بسته به pH محيطي که در آن قرار مي گيرد داراي بار الکتريکي خالص متفاوتي خواهد شد. pI هيستيدين برابر با 8/7 است, مولکول در pI خود داراي بارالکتريکي خالص صفر است. هيستيدين در pH بالاتر از pI خود داراي بار الکتريکي خالص منفي و در pH پايين تر داراي بار الکتريکي خالص مثبت خواهد شد(شکل 3-5).
همين وضعيت در مورد ديگر اسيدهاي آمينه بازي مثل لايزين كه داراي گروه آمين در موقعيت اپسيلون زنجيره جانبی خود است و آرژی نين كه دو گروه آميني دارد, رخ مي دهد؛ بدين ترتيب که گروه آميني در pH پايين تر از pKa خود داراي بار مثبت و در pH بالاتر از pKa بدون بار الکتريکي هستند؛ بدين ترتيب اسيد آمينه در مقادير pH كمتر از pI داراي بار مثبت و در مقادير pH بالاتر از pI منفي است. برعكس،گروه هاي كربوکسيل زنجيره ي جانبي اسيدهاي آمينه ی اسيدي مثل اسيد آسپارتيك و اسيد گلوتاميك که در pH هايي بالاتر از ميزان pKa خود داراي بار منفي و درمقادير pH كمتر از مقادير pKa بدون بار الکتريکي خواهند بود؛ در نتيجه کل مولکول مانند اسيد هاي آمينه بازي در مقادير pH كمتر از pI داراي
بار مثبت و در مقادير pH بالاتر از pI منفي خواهند بود (شکل 3-6).
نسبت گروه هاي جانبي اسيدهاي آمينه موجود در يک پروتئين كه داراي بار الكتريكي يا بدون بار الكتريكي هستند, بستگي به pH محلول خارجي دارد كه در آن قرار دارند. براي مثال در يك pH بالا مثل 12 گروه هاي كربوكسيل داراي بار الكتريكي منفي هستند و زنجيره هاي جانبي اسيدهاي آمينه بازي بدون بارالكتريكي هستند در حاليكه درpH هاي پايين و كمتر از 4، گروه هاي كربوكسيل اسيدهاي آمينه اسيدي بدون بار الكتريكي و اسيدهاي آمينه بازي داراي بار الكتريكي مثبت هستند. بنابراين اگر پروتئين داراي ميزان بيشتري از اسيدهای آمينه گلوتاميك اسيد و آسپارتيك اسيد باشد معمولاً درگروه پروتئينهاي اسيدي دسته بندي مي شود زيرا در pH خنثی داراي بار الكتريكي خالصِ منفي است. بالعكس اگر پروتئيني داراي اسيدهاي آمينه بازي بيشتري باشد يعني داراي لايزين و آرژی نين بيشتر باشد, در pH خنثی بار مثبت خالص خواهد داشت.
بدين ترتيب پروتئين ها در pH بالاتر از pI خود داراي بار منفي و در pH پايين تر از pI خود داراي بار مثبت خواهند بود. بطور عملي pI يك پروتئين (نقطة ايزوالكتريك پروتئين) جايي در يك ميدان الكتريكي است که پروتئين نه به سمت كاتد (الکترود منفي) مهاجرت مي كند و نه به سمت آند (الكترود مثبت).
در حضور يک گرادیان pH و تحت تاثير يک ميدان الکتريکي پروتئين به سمت نقطه اي در شيب حرکت مي کند که بارالکتريکي خالصش صفر شود. پروتئيني با بار الکتريکي خالص منفي به سمت آند مهاجرت خواهد کرد, تا جايي که بار الکتريکي منفي اش کمتر شود تا به بار الکتريکي صفر برسد. در صورتيکه اين پروتئين از محدوده ي pI خود خارج شود, فورا" بار دار مي شود و به pI خود باز مي گردد. در واقع اين پديده ي فوکوسينگ يا متمرکز شدن در يک نقطه است که در "IEF" صورت مي پذيرد و باعث تجمع و تمرکز يک پروتئين در نقطه ايزو الکتريک خود شده و ابزاري قدرتمند در جداسازي پروتئين ها براساس اختلاف هرچند ناچيز در بار الکتريکي شان در اختيار قرار مي دهد.
http://pnu-club.com/imported/mising.jpg
