توليد داربست هاي پليمري: پليمريزاسيون (بسپارش)

[javad jan]

توليد داربست هاي پليمري: پليمريزاسيون (بسپارش)
processing of polymer scaffolds : Polymerization
پال- دي- دالتون، ساروجيني ويجاياسكاران، و مولي- اس- شويچتپيشگفتارداربست هاي به دست آمده از طريق روش بسپارش كانيدهاي خوبي براي مهندسي بافت به شمار رفته و به دليل سهولت ساخت نسبت به روش ديگر ساخت داربست ارجحيت دارند. با وجوديكه پليمرهاي مختلفي را مي توان به اين روش بسپارش كرد. اما تعداد كمي از آنها منجر به داربست هايي با قابليت دخول سلول يا همان داربست هاي متخلخل مي شوند. براي نمونه پلي اتيلن گليكول- مالتي-اكريليت و پلي 2- هيدروكسي اتيل متا اكريلات (phema) مي توانند به صورت شبكه اي يا به حالت اصلي بسپارش شوند، هر چند ساختار ايجاد شده به جاي داربستي با خلل و فرج هاي بزرگ درهم براي نفوذپذيري سلول ها به شكل ژل مي باشد. با دستكاري (تغيير) شرايط بسپارش مي توان داربست هاي متخلخل از phema و پلي- ان- 2-هيدروكسي پروپيل متا اكريلاميد (phpma) ايجاد كرد. به طور خلاصه تركيب منومري (تك پار) در حضور حلالي كه منومر در آن قابل حل ولي پليمر غير قابل حل است، درون قالب بسپارش مي شود. گذار حلاليت درخلال بسپارش منجر به دو فاز مي گردد، ساختار زيستي پيوسته پليمر و حلال (شكل 1-63) بدين ترتيب، داربست توليد شده در نتيجه بسپارش براي ايجاد خلل و فرج هاي در هم نيازي به پالايش پروژن ندارد. براي داربست هاي phema با قابليت دخول سلول كه اغلب به نام اسفنج هاي phema خوانده مي شوند حلال مازاد معمولاً آب است.

[javad jan]

اسفنج هاي phema نخستين بار در سال 1960 ساخته شده و اولين كاربرد باليني آنها افزايش حجم پستان و جايگزيني عضروف بيني بود. اسفنج‏هاي phema قابليت تحمل اتوكلاو را داشته و به سادگي به اشكال مختلف تغيير فرم مي دهند و به خاطر خصوصيات فيزيكي اسفنجي براي جراح مانند بافت نرم هستند. برخي از محققين ، اسفنج هاي phema را جايگزين بافت نرم با قابليت كاربردي متنوع ناميده اند. با اين حال آهكي شدن آنها در محيط آزمايشگاه در مدت زمان طولاني سبب كند شدن سرعت توسعه اسفنج هاي phema تا اوايل 1990 يعني زماني كه چيريلا از اسفنج هاي phema براي پروژه قرنيه مصنوعي استفاده كرد، شد. اسفنج هاي phema از آن موقع به بعد به عنوان حاشيه متخلخل قرنيه مصنوعي كه باموفقيت هاي باليني فراواني مواجه شد توسعه يافتند. داربست هاي phema قابل نفوذ براي سلول ها بوده و به همين دليل به عنوان يك قلاب (نگهدارنده) بين بافت قرنيه و هسته مركزي شفاف غيرقابل نفوذ به كار برده مي شود همچنين ميتوان با تلفيق اسفنج هاي phema با كاشتني چشمي (اربيتال) سبب نفوذ ماهيچه ها به داخل اجزاء phema شد.
تست هاي آزمايشگاهي و درون بدني اسفنج هاي phema لزوم نفوذ (هجوم) سلول را براي كاربردهاي مهندسي بافت ثابت كرده اند. اشكال مختلف داربست به واسطه پيامد بسپارش اجازه تغيير ساختار مصنوعي را در حين سنتز مي دهد. اين فصل روش تحليل ساخت اسفنجهاي phema قابل توليد در آزمايشگاههاي تحقيقاتي را تشريح مي‌كند.

[javad jan]

معرف ها(شناسگرها)reagents

سيستم هاي آغاز كننده و منومر اسفنج هاي phema گران نبوده و مواد شيمايي فوق آماده مصرف هستند. مواد شيميايي فهرست شده در جدول 1-63 و 2-63 از آليدرچ (ميلواكي ايالت ويسكانسين) قابل خريداري هستند. آب به كار رفته معمولاً مقطر بوده و يون زدايي شده است و داراي مقاومت m18 مي باشد، ميلي پور ميلي رو مثبت 10 و ميلي- كيويواف مثبت (بدفورد، ايالت ماساچوست)

[javad jan]

-روش هاMETHODS مراحل كليدي در سنتز اسفنج هاي PHEMA براي مقاصد پزشكي- زيستي عبارتند از:
- تهيه قالب
- تهيه فرمولاسيون
- اعمال- تزريق فرمولاسيون به قالب
- بسپارش و تشكيل داربست
- استخراج ساكس هلت (soxhlet) داربست
- استريلزاسيون (سترون كردن)
- نفوذ سلولي داربست
- پردازش ساختار بافت

[javad jan]

-تهيه قالبmold preparation

قالب ها بايد قبل از تهيه فرمولاسيون بسپارش آماده باشند. قالب بايد هم در دسترس بوده (به عبارت ديگر شيشه يا پلي پروپيلن) و هم به طور كامل با الكل قابل پاك كردن باشند (به عبارت ديگر تفلون). از آنجا كه phema به پلي استايرن فولاد و لوله تايگون مي چسبد حفظ كيفيت سطوح در هنگام استفاده از اين مواد به عنوان قالب مشكل است

[javad jan]

-تهيه فرمولاسيونformulation preparation
تهيه تركيب منومر ساده است: ابتدا همه سيالات فهرست شده در جدول 1-63 را به غير از عامل شتاب دهنده ( - تترامتيل اتيلن ديامين، temed ) در ظرف شيشه اي به هم اضافه مي كنيم. ظرف را به مدت 3 دقيقه در حمام اولتراسونيك- قرار مي دهيم و مراقب هستيم تا دماي حمام ثابت باقي بماند. بعد از اضافه كردن عامل شتاب دهنده، تركيب را براي 30 ثانيه به آرامي تكان داده يا مي غلطانيم. از حركت شديد و تند خودداري مي كنيم زيرا كه ممكن است سبب ورود اكسيژن به داخل تركيب شده و جنبش بسپارش را تغيير دهد. فرمولاسيون فوق را مي توان اكنون به داخل قالب تزريق كرد.

[javad jan]

-اعمال-تزريق فرمولاسيون به قالب
dispensing / injection formulation into molds
فرمولاسيون به دست آمده را ميتوان با يك سرنگ يك بار مصرف با سوزن درجه 18 به قالب مورد نظر كه داراي شكل و ابعاد مطلوب محصول نهايي است تزريق نمود. جلوگري از ايجاد حباب در زمان تزريق فرمولاسيون از اهميت ويژه اي برخوردار است. فرمولاسيون بايد قبل از رخ دادن تفكيك فاز (به عبارت ديگر سفيد شدگي) تزريق شود.

[javad jan]

-بسپارش و تشكيل داربست
POLYMERIZATION AND FORMATION OF SCAFFOLD
از آنجا كه دما بر جنبش بسپارش تأثير مي گذارد حفظ دماي ثابت قالب در طول بسپارش ضروري است. زمان بسپارش در حدود 10-2 ساعت در دماي اتاق بوده و به تركيب دقيق فرمولاسيون بستگي دارد. فرمولاسيون هاي حاوي آغاز كننده ها و يا عامل هاي شبكه ساز كمتر معمولاً به زمان بيشتري براي شكل گيري قالب نياز دارد. قالب ها معمولاً در طول شب باقي مانده و يا در فري با دماي C 0 50 به مدت 3 ساعت پس از سپري شدن 10-2 ساعت نخستين از تبديل كامل و باقي ماندن كمترين ميزان منومرها قرار داده مي شود. تفكيك فاز و ژل سازي دو تغير فيزيكي هستند كه در حين بسپارش قابل مشاهده هستند. تفكيك فاز يا سفيد شدگي فرمولاسيون را مي توان با طيف سنجي در nm550 پس از 60-5 دقيقه (به عكس العمل كنتيك ها بستگي دارد) تشخيص داد. استفاده از كووت هاي پلي استايرن يك بار مصرف براي سنجش نور بهترين انتخاب است چرا كه پليمر به سطوح كوارتز مي چسبد. بعد از تفكيك فاز، تركيب در حالت سيال باقي مانده تا ذرات ژل فاز كه متناسب با كنتيك ها مي توانند از 30 ثانيه تا 1 ساعت زمان اضافي ببرند جدا شود. توجه به اين نكته مهم است كه بدانيم داربست نتيجه تفكيك فازي و سپس ژل شدگي است و اگر اين ترتيب برعكس شود به جاي داربست ژل به دست مي آيد. تغيير فاز در 75% آب در زمان وقوع ژل شدگي قبل از تفكيك فاز سبب غير قابل نفوذ شدن ژل ها در برابر سلول ها مي شود. بنابراين بهترين وضعيت حفظ تعادل 80% آب در فرمولاسيون است تا حالت نفوذ پذيري داربست در برابر سلول حفظ شود. محدوده اندازه خلل و فرج متناسب با فرمولاسيون از 2 تاhttp://pnu-club.com/imported/mising.jpg 80 تغيير مي‌كند.

[javad jan]

-استخراج ساكس هلت داربست
SOXHLET EXTRACTION OF SCAFFOLD
تحقيقات چيفكوفي و همكارانش نشان داد كه آ‎ب استخراج شده از ژل هاي PHEMA و تزريق شده به درون پوست موش ها نسبتاً دردناك است. بنابراين خارج كردن همه عوال سمي از اسفنج هاي PHEM قبل از اعمال به بافت بسيار مهم است. همچنين اگر اكريلاميد كه يك نورو توكسين قدرتمند است يك كومونومور باشد اهميت دوچندان مي شود. روش استخراج ساكس هلت راحت ترين و مؤثرترين شيوه براي خارج سازي مونور باقيمانده و يا هر آغاز گر غير فعال ديگري است. نمونه هاي كوچك را مي توان در انگشتانه يا كاست رشد قرار داده تا از كشيده شدن آنها به درون جريان خروجي محفظه نمونه جلوگيري كرد. اگر اسفنج هاي اصلاح شده نسبت به دما حساس بوه و يا شامل ذرات تخريب پذير باشند مي توان استخراج را در دماي پائين توسط دستگاه جانبي سردساز متصل به محفظه نمونه يا با سيستم ساكس هلت به اجرا در آورد. در زمان كار تحت خلاء از تطبيق ساز مدخل مويرگ خوني در يك فلاسك با كف گرد و دو گردنه جهت توليد رشته اي از حباب هاي هوا براي جلوگيري از ضربه استفاده مي شود. استخراج اسفنج هاي PHEM معمولاً درطول شب انجام مي شود. حداقل تعداد شستشوهاي ضروري براي خارج كردن اجزا سمي نامشخص است اما مقدار يك يا دو استخراج ml40 شايد كافي باشد. از روغن كاري بين مفاصل كاملاً حذر كرده و چربي احتمالي را با كلروفرم يا استون به خوبي پاك مي كنيم.

[javad jan]

-استريليزاسيون (سترون كردن)STERILIZATION
اسفنج هاي PHEMA را ميتوان تحت اتوكلاو قرار داده و ترجيحاً در آب داخل محفظه درب دار غير پيچشي براي جلوگيري از افزايش فشار، غوطه ور ساخت. اسفنج هاي PHEMA در اثر حضور در چنين دماهايي كمترين تخريب را از خود نشان مي دهند. از پرتودهي گاما ، (KGy 25) نيز مي توان بهره گرفت. التبه احتمال تغيير جزئي حجم شبكه يا بريدگي زنجير وجود دارد.

[javad jan]

-نفوذ سلولي داربست هاcellular penetration of scaffolds
روش هاي استاندارد كشت سلولي را مي توان براي كاشت اسفنج هاphema استريل در محل بافت مورد نظر يا بارور كردن آنها با سلول ها براي كشت آزمايشگاهي به كار برد. براي بالا بردن نفوذ سلولي اسفنج هاي phema مي توان «پوسته» متخلخل كمتري كه نمونه قالب گيري شده را احاطه كرده است برداشت. اين كار را مي توان با ماشين تراش (بر روي نمونه هاي منجمد) يا توسط تيغ (داربست هاي نيمه منجمد شده در دماي c0 78- به مدت 10 دقيقه) انجام داد. از غوطه ور شدن اسفنج ها در نيتروژن مايع بايد حذر كرد چرا كه سبب از هم پاشيدن اسفنج مي شود. البته اين روش براي تصوير برداري ميكروسكوپي اسكن الكترون (sem) مي تواند مفيد باشد. (استخراج ساكس هلت، ترك خوردگي را كاهش مي دهد) مطلوب است كه اسفنج هاي phema ساخته شده در حمام اولتراسونيك بدون پوسته باشند. البته گرماي توليد شده در سونيكاتور مي تواند بر جنبش بسپارش اثر بگذارد.

[javad jan]

-پردازش ساختار بافتHISTOLOGICAL PROCESSING
مورفولوژي كلي و تغييرات فوق ساختاري در برون كاشتي ها يا اسفنج هاي كشت شده PHEMA را ميتوان توسط ميكروسكوپ چشمي و ميكروسكوپ انتقال الكترون (TEM) بر بافت پردازش شده در صمغ اپوكسي مشاهده كرد. كاشتني هاي خارج شده از بدن بايد به مدت 48-24 ساعت در 5/2% گلوتارآلدهيد نگهداري شده و از قبل در 1% اسميوم تتراكسايد تثبيت شوند. نمونه ها توسط محلول هاي درجه بندي شده اتانول آب گيري شده و سپس در اكسيد پروپيلن غوطه ور مي شوند. سپس نمونه به وسيله صمغ اپوكسي و تعويض روزانه صمغ قديم با صمغ تازه به مدت 72 ساعت پالايش مي شوند. قسمت هاي نيمه نازك (​2) براي ميكروسكوپ چشمي و قسمت هاي فوق نازك (nm1/0) براي TEM توسط يك فراميكروتوم (فراريزبر) با تيغه الماس بريده مي شوند. لكه هاي بررسي شده براي آزمايش نور شامل هماتوكسيلين و ائوسين، قرمز اليزارين (روناس)، سه رنگ طبيعي (تري كروم) ميسون و آبي تلوئيدين مي شود. به غير از لكه آبي تلوئيدين، بخش هاي ديگر بايد با غوطه ور شدن به مدت 2 دقيقه در اتوكسيد سديم وهيدراته شدن از طريق محلول هاي درجه بندي شده اتانول پلاستيكه شوند.

[javad jan]

تجمع تحريك آميز سلول را در اسفنج هاي برون كاشتني PHEMA را مي توان توسط تمركز ايمني شيميايي ياخته هاي ماكروفاژ با استفاده از به كارگيري پادتن ها بر ماكروفاژهاي بخش هاي منجمد شده و پارافيني بافت تثبيت شده در 2% پارافرم آلدئيد شناسائي كرد. نوتروفيلها را مي توان با اعمال ‎آنزيم شيمي بافت بر بخش هاي منجمد تثبيت شده در سيتوات – استون فرم آلدئيد نگهداري شده در كلرواستات AS-D نفتال در PH 3/6 به مدت 15 دقيقه در تاريكي و دماي C0 37 شناسائي كرده و توسط هماتوكسيلين با لكه ها مقابله كرد. عبارت ماهيچه صاف http://pnu-club.com/imported/mising.jpg اكتين به عنوان علامت شيميايي تبديل مايوفيبربلاست به كار رفته و توسط روش هاي متمركز سازي ايمني ياخته شيميايي در كشت سلولي قابل شناسائي است.
محصول ماتريس برون سلولي در برون كاشتني ها PHEMA توسط اتوراديو گرافي شناسائي مي شوند. كلاژن توليد شده توسط سلول ها ونوع آن را مي توان با استفاده از پرولين H ]3 –3 و 2[- (مقدماتي) و تمركز ايمني ياخته شيميايي انواع كلاژن I- VI با پادتن هاي انساني و كلاژن گاوي شناسائي كرد. اين موضوع نشان مي دهد كه اسفنج هاي PHEMA هم نفوذ و هم ته نشيني سلول را ميسر ساخته و يك داربست بافت سه بعدي پايدار و اشكل مي دهد.
چگالي و زيست پذيري سلول را ميتوان با استفاده از تصحيح روش لك اندازي فلورسانت كه توسط پول و همكارانش صورت گرفت انجام داد. اين روش بسيار حساس و قابل اطمينان از دو نوع رنگ فلورسانت استفاده مي‌كند: 5-كلرومتيل فلورسئين دي استيت (CMFDA) و اتيديم و هموديمر (هم پار) 1 كه به ترتيب جهت شناسايي سلول هاي زنده و مرده مورد استفاده قرار مي گيرد. نمونه هاي بافتي برون كاشته شده با اهداف متفاوت همراه با CMFDA و يا با اتيديم هموديمر 1 به مدت 24 ساعت در C0 37 نگهداري مي شوند. بعد از آن گونه ها به طور مختصر در 2% پارافرمالدهايد تثبيت شده و در دماي بهينه برش محيط پيرامون منجمد (OCT) مي شوند. بخش هاي منجمد شده را مي توان بر روي اسلايدهاي پوشيده شده با آمينو پروپيل تري تكسي سيلان جمع آوري كرده و در ميكروسوپ فلورسانت مشاهده نمود و بدين ترتيب تحليل نيمه كمي از سلول هاي زنده و مرده به عمل آورد.

[javad jan]

-اشارات و فوت و فن هاtips and know – how
نرخ منومر در آب تنها فاكتور مهم در كنترل مورفولوژي نهايي است . متغيرهاي ديگري كه مي توانند بر مورفولوژي نهايي تأثير بگذارند شامل دماي زمان بسپارش، مقدار اكسيژن حل شده در تركيب منومر و غلظت و نوع مواد شيمايي در تركيب منومر است.
تثبيت اين پارامترها در زمان بررسي اثر تغيير يكي از آنها بسيار مهم است.

[javad jan]

HEMA بايد يك سيال صاف بوده و اگر هر گونه زردي در آن مشاهده شود بايد منومر خارج گردد. HEMA معمولاً قبل از استفاده تحت خلاء تقطير مي شود و در صورتي كه باز دارنده ها (ممانعت كننده ها) و هيدروكوئينين مونومتيل اتر (MEHQ) را از آن خارج كنيم زمان ذخيره سازي (نگهداري) آن كوتاه مي شود. اگر HEMA با خلوص بالا حاوي كمتر از ppm50 ، MEHQ خريداري شود و بطري آن به طور مرتب تعويض شودHEMA را مي توان بسادگي پس از دريافت استفاده كرد. بهتر است كه منبع ويژه HEMA را انتخاب كرده و مقادير كمي از آن به عنوان توزيع كننده، نگهداري شود و هر 6 ماه يك بار يك بطري جديد سفارش داده شود.

[javad jan]

معمولاً مقداري اتيلن دي متا اكريليت ‍(EDMA) در HEMA خريداري شده وجود دارد كه براي بررسي حساسيت با تخريب پذيري مي توان EDMA را به وسيله استخراج در هگزان خارج كرد. براي استفاده عمومي، نيازي به خارج سازي EDMA از HEMA نبوده و براي ايجاد همخواني (سازگاري) بين دسته ها توصيه مي شود كه HEMA را توسط غلظت مشخصي از EDMA خنثي كرد. اين كار از واكنش كنتيك متغيرها جلوگيري كرده و خطاهاي ناشي از رهايش مقادير كم EDMA به تركيب منومر را برطرف مي‌كند. عامل شبكه ساز با اثر گذاري بر كنتيك هاي واكنش مصرف HEMA و همچنين كنتيك هاي تفكيك فاز در برابر ژل شدگي نقش پيچيده اي را در آرايش داربست بازي مي‌كند. برخلاف ژل هاي PHEMA ارتباط زيادي بين غلظت عامل شبكه ساز و استحكام داربست هاي PHEMA وجود ندارد غلظت معمول به كار رفته EDMA براي داربست ها در حدود %wt25/0 –1/0 است.

[javad jan]

محلول تازه پرسولفات آمونيوم (APS) بايد براي هر فرمولاسيون تهيه شده و ساده ترين روش براي اين فرايند تكراري سنجش دقيق g(*) 1/0 و پوشاندن ظرف با آب تا g(*)1 است. وزن ظرف بايد در تعادل وزني بين APS اضافي و آب محاسبه شود. اسفنج هاي PHEMA ساخته شده با غلظت هاي كم APS معمولاً ضعيف و چسبنده هستند. در صورتي كه تمايل به واكنش آرام داشته باشيم به جاي بازدارنده مي توانيم از عامل شتاب دهنده با غلظت ضعيف تر استفاده كنيم.به طور كلي غلظت APS بايد بيشتر از wt%3/0 غلطت منومر باشد. براي غلظت هاي پائين تر منومر ممكن است نياز به غلظت بالاتر باشد. براي مثال براي يك تركيب 10:90، HEMA و آب، غلظت wt%5/0 توصيه مي شود. TEMED به محض دريافت با توزيع در تركيب منومر توسط ميكروپيپت استفاده مي شود. TEMED يك اهدا كننده الكترون بسيار قدرتمند تر از ديگر عامل هاي شتاب دهنده (تسريع كننده) مانند متابي سولفات سديم (SMBS) و اسيد اسكوربيك بوده و در نتيجه نرخ واكنش آن بسيار سريع تر است. هنگامي كه عامل شتاب دهنده SMBS باشد لايه لايه شدگي و استقرار ورفولوژي مشاهده مي شود.

[javad jan]

براي خارج كردن اكسيژن حل شده مي توان گاز نيتروژن يا هليوم را براي مدت زمان مشخصي (~15 دقيقه) به شكل حباب در تركيب منومر وا رد كرده و يا اينكه ميتوان منو ر را به صورت عرضه شده (تحت پردازش قرار نگرفته) مصرف كرد. اسفنج phemaرا كه با گاز خنثي حباب دار شده اند را با آنهايي كه نشده اند مقايسه نكنيد. خروج اكسيژن حل شده بر نرخ واكنش و در نتيجه مورفولوژي تأثير مي گذارد. در صورت استفاده از منومر عرضه شده انسجام (هم خواني) هر تركيب ضروري است.

[javad jan]

-نتايج و خط مشي آيندهconclusions and future directions
تهيه داربست نفوذ پذير سلولي phema ساخته شده توسط بسپارش hema در آب اضافي و اتوكلاوكردن آنها راحت بوده و گران نمي باشد. علاوه بر اين طرح شيمي ارائه شده در اين فصل اجازه ساخت مكرر داربست هاي phema را مي دهد. داربست هاي phema در آب فرسوده نشده و توليد محصولات تخريبي نمي كند و حد فاصل سلول- سطح داربست پايدار است. اصلاح سطح مانند افزودن پپتيد يا مولكول هاي زيست فعال تترينگ به اين دار بست مصنوعي امكان پذير بوده و از عملكرد هيدروكسيل بهره مي برد.

[javad jan]

اسفنج هاي PHEMA را ميتوان با مقادير بسيار كم عامل شبكه ساز (wt%05/0~) ساخته و هر گونه ناخالصي EDMA قابل حذف كردن است. در صورتي كه داربست هاي PHEMA جهت تخريب اصلاح شوند، آزمايشات ارزيابي تورم كاشتني و محصولات سمي و تخريب پذير لازم خواهد بود.
تشكيل داربست توسط بسپارش نسبت به روش هاي ديگر تهيه داربست داراي مزايايي است. داربست در حين بسپارش از نواحي عاري از پليمر و غني از پليمر تشكيل شده و بدين ترتيب شكل و مورفولوژي را مي توان بالقوه توسط تحريكات خارجي از قبيل نيروهاي سانتريفوژ يا نور تغيير داد. چنين كنترلي بر شكل داربست، مي تواند منجر به چندگاني مورفولوژي ها و هندسه آنها شده كه براي كاربردهاي مهندسي بافت مطلوب است.