Borna66
04-10-2009, 04:51 PM
روشهاي آشكارسازي پروتئينها بر روي ژلهاي دوبعدي را مي توان به 5 نوع اساسي تقسيم كرد:
رنگ آميزي با رنگهاي آنيونيك نظير كوماسي بلو
رنگ آميزي منفي با كاتيونهاي فلزي مثل رنگ آميزي زينك يا روي
رنگ آميزي Silver يا نقره
فلورسانس
ايزوتوپهاي راديواكتيو با استفاده از اتوراديوگرافي ، فلوروگرافي يا فسفرو ايميجينگ
در اغلب اين روشهاي رنگ آميزي پلي پپتيد هاي تفكيك شده بايد حداقل چند ساعت درمحلولي حاوي اتانول, استيك اسيد و آب تثبيت شوند.
6-1- رنگ آميزي آبي کوماسي و ايميدازول
روش انتخابي برای رنگ آميزی ژل پس از انجام 2D-PAGE بستگی به طبيعت نمونه اوليه و هدف آزمايش دارد. برای شناسايی پروتئين ها با استفاده از ژل های Preparative و طيف سنجی جرمی يک روش رنگ آميزی قابل برگشت مورد نياز است. رنگ آميزی ژل پلی آکريل آميد با آبی کوماسی يا ايميدازول – روی نتايج مطلوبی بدست می دهد که با روشهای طيف سنجی جرمی سازگار است
آبی کوماسی اساساً اولين بار براي رنگ آميزی اسيدی پشم تهيه شد. دو گونه ي مختلف از اين رنگ وجود دارد که به نامهای آبی کوماسی G-250 و R-250 شناخته می شوند و به ترتيب دارای ته رنگ سبز و قرمز هستند. عدد 250 نيز معرف قدرت رنگ است که اولين بار توسط توليد کنندة آن Imperial Chemical Industries مورد استفاه قرارگرفت. اگر چه اين شرکت ديگر رنگ را توليد نمی کند ولی علامت تجاری اين محصول به آن تعلق دارد. روش رنگ آميزی رايج ژلهای پلی آکريل آميد با آبی کوماسی که در ترکيب با اسيد استيک و متانل بکار مي رود، سالهاست که مورد استفاده قرار می گيرد. رنگ کوماسی آبی G-250 با اسيدهای آمينه قليايی از جمله آرژی نين ، تيروزين ، ليزين و هيستيدين ايجاد کمپلکس می کند. اما رنگ شديد زمينه و متعاقب آن نياز به مراحل متعدد رنگ زدايی از نکات منفي اين روش است.
روش رنگ آميزی ايميدازول - روی که توسط Ortiz و همکارانش ابداع شد يک روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ي ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. در اين روش در مناطقی از ژل که حاوی پروتئين نيستند, کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی رسوب ميکنند, که يک زمينه ي سفيد کدر روی ژل ايجاد می کند. مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند شفاف باقی می مانند. اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها نيم ساعت طول می کشد. علاوه بر اين ، نيازی به تثبيت پروتئين ها در ژل وجود ندارد. برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد. در اينجا هر دو روش شرح داده می شود . اين روشها را برای ژلهای 2-D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد. برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول- روی را می توان کاهش داد.
همة محلولها بايد در ظروف شيشه ای و با آب مقطر ديونيزه تهيه شوند. محلولهای رنگ آميزی آبی کوماسی G-250 عبارتند از محلول تثبيت کننده و محلول رنگ آبی کوماسی G-250. محلول های روش رنگ آميزی منفی ايميدازول-روی عبارتند از محلول کربنات سديم، محلول ايميدازول SDS ،محلول استات روی. هرگونه ذرات معلق بايد توسط کاغذ ----- Whatman شماره 1 صاف شود. در اين روش ها تمام محلول ها و ژلها بايد با دستکش کار شوند و تمام مراحل کار در دمای اتاق و در ظروف رنگ آميزی و روی شيکر[1] انجام شود.
در روش رنگ آميزی با آبی کوماسی G-250, تثبيت ژل بلافاصله پس از الکتروفورز انجام می شود. با اين وجود بايد توجه داشت که مرحله تثبيت کردن در اين روش رنگ آميزی يک ضرورت نيست.
مرحله تثبيت ژل در روش ايميدازول-روی ضروری نيست و ژلها بلافاصله پس از الکتروفورز رنگ آميزی می شوند. برای مشاهده ي بهتر، رنگ آميزی ژل در يک زمينه تيره برای تشخيص نحوه ي ظهور رنگ ايده آل خواهد بود. هنگامی که وضوح مطلوب بر روی ژل مشاهده شد پروتئين ها بصورت مناطق شفاف در يک زمينة مات سفيد خود را نشان می دهند.
نکته ها :
رنگ آميزی با آبی کوماسی R-250 با روشهای طيف سنجی جرمی سازگاراست.
تفاوتهايی در حساسيت و زمان رنگ آميزی روشهای شرح داده شدة فوق وجود دارد. تجربه نشان داده است که حساسيت روش رنگ آميزی ايميدازول روی به اندازة روش نقره است (10-1 نانوگرم BSA ) و حدود نيم ساعت طول می کشد. در بين روشهای فوق ، روش رنگ آميزی منفی از همه سريعتر و حساستر است. اما اين ژلها اندکی شکننده تر بنظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. روش استاندارد کوماسی R-250 از بقيه حساسيت کمتری دارد و الکل زيادی نيز مصرف می کند.
اگر با ژل ها با ملايمت رفتار نشود ترک می خورند و می شکنند. اگر چنين اتفاقاتی برای ژل زياد روی می دهد اکريل آميد را با دورآکريل[2] جايگزين کنيد.
ظرف رنگ آميزی بايد به گونه ای انتخاب شود که اندکی بزرگتر از ژل باشد. ژلها به ويژه ژلهای بزرگ، بايد در ظروف جداگانه رنگ آميزی شوند. ظروف پلاستيکی مناسب برای رنگ آميزی ارجحيت دارند اما ظروف شيشه ای نيز مناسب هستند .
طيف سنجی پپتيدی و طيف مربوط به ترادف پپتيدها را با کيفيت خوبی می توان از پروتئين بدست آمده از يک الی چهار نقطه بدست آمده از ژلهای مشابهی که با هرکدام از روشهای رنگ آميزی گفته شده در اين بخش رنگ شده باشند بدست آورد. آبی کوماسی را می توان در طی هضم داخل ژل توسط تريپسين، با کمک حلالهای آلی از بين برد. تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان پيش از قراردادن در معرض تريپسين، توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد. البته اين کار ضروری نيست . بايد توجه نمود که رنگ آميزی نقره نيز با اعمال تغييراتی می تواند با طيف سنجی جرمی سازگار شوند.
6-2- روش رنگ آميزی کوماسی کلوئيدی:
در سال 1985 Neuhoff روشی حساس برای رنگ آميزی پروتئين در ژلهای آکريلاميد بر پاية ويژگی کلوئيدی آبی کوماسی G-250 ارائه کرد. اين روش درکمتر از يک ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. اين روش بعداً توسط همان گروه بهبود يافت.
افزودن متانل و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد. فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل می شود و پروتئين ها را رنگ می کند. حال آنکه فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.
پروتکل های متعددی برای رنگ آميزی با کوماسی و نيز تعداد مختلفی رنگ کوماسی وجود دارد. اين روشها سريع و ارزان هستند هرچند که مرحله تهيه رنگ می تواند اندکی همراه با آلودگی با رنگ باشد. بهتر است محلول رنگ را به فواصل زمانی مشخصی تجديد کرد چون رنگ کهنه حساسيت خود را از دست می دهد. همچنين می توان محلولهای آماده رنگ را البته با قيمت بيشتر خريداری کرد. اغلب شرکتهايی که اين رنگها را توليد می کنند ادعا می کنند که اين رنگها از رنگهای کوماسی مرسوم حساستر هستند و رنگ زدايی کمتر احتياج دارند و بعلاوه ، مواد غير پروتئينی از جمله پلی ساکاريدها را هم رنگ می کند.
تمام مراحل کار روی يک شيکر چرخان با دور ملايم انجام می شوند. بدنبال الکتروفورز، ژل را در محلول رنگ کوماسی کلوئيدی قرار می گيرد. محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد. ژل حدود 6 ساعت يا شب تا صبح درمحلول رنگ قرار داده می شود. در انتها ژل چندين بار با آب مقطر شسته می شود تا زمينة ژل شفاف شود .
6-3- رنگ آميزي نيترات نقره
رنگ آميزي نقره ژلهاي پلي آکريل آميد اولين بار در سال 1979 توسط Switzer و همکارانش، معرفي شد، و به دليل حساسيت بالاي آن به سرعت عموميت پيدا کرد. حساسيت اين روش حدودا" صد بار بيشتر از روش رنگ آميزي با آبي کوماسي است. با اين وجود، دستورالعمل هاي اوليه رنگ آميزي نقره خالي از اشکال نبودندو رنگهاي پس زمينه روي ژل و متعاقباً کاهش حساسيت و کاهش تکرارپذيري مکرراً تجربه مي شد.
اين موضوع منجر شد به اينکه بسياري از نويسندگان پروتوکل هاي اصلاح شده اي را پيشنهاد کنند بنحوي که امروزه بيش از يکصد پروتوکل مختلف براي رنگ آميزي نقره در منابع علمي يافت مي شود. با اين وجود ، تمام اين روشها بر پايه اصول مشترکي قرار دارند
مرحله اول عبارتست از تثبيت يا fixation و هدف آن غيرمحلول نمودن پروتئين ها در درون ژل و نيز شستن ترکيبات تداخل کننده اي است که در ژلهاي 2-D وجود دارند, از جمله گلايسين ، تريس ، SDS و کريرآمفولايت هايي که در ته ژلها وجود دارند.
مرحله دوم حساس نمودن است و هدف از اين مرحله افزايش دادن امکان ظهور نقاط در مراحل بعدي است. ترکيبات بي شماري براي اين منظور پيشنهاد شده اند. تمام اين ترکيبات به پروتئين ها متصل مي شوند و همچنين قادرند که به يون نقره متصل شوند و يا اينکه يون نقره را به نقره فلزي يا سولفيد نقره تبديل کنند. مرحله حساس نمودن گاهي با مرحله فيکس کردن همزمان انجام مي شود.
مرحله سوم اضافه کردن نقره است که در اين مرحله مي توان از نيترات نقره ساده يا نقره آمونياکي استفاده کرد.
مرحله چهارم و آخر عبارتست از ظهور ژلهايي که در نيترات نقره غوطه ور بوده اند. محلول ظهور حاوي فرم آلدئيد ، کربنات و تيوسولفات است. استفاده از ترکيب اخير که توسط Blum و همکاران معرفي شده است باعث کاهش قابل ملاحظه اي در پس زمينه و نيز ظهور کامل تصوير مي شود. در ژلهايي که در محلول نقره آمونياکي بوده اند محلول ظهور بايد حاوي فرمالدئيد و اسيدسيتريک باشد. براي کاهش رنگ زمينه همچنين مي توان ژل را پيش از مرحله ظهور مختصراً در تيوسولفات قرار داد يا اينکه آنرا درمحلول ظهور لحاظ کرد. زماني که حدمطلوب ظهور تصوير بدست آمد، با قراردادن ژن در محلول متوقف کننده از ادامه ظهور جلوگيري مي شود. اين محلول عموماً محتوي اسيداستيک و يک آمين است که pH آنرا به 7 برساند. تثبيت نهايي تصوير ژل با شستن کامل آن در آب بدست مي آيد.
عموما" از ظروف شيشه اي يا ظروف دردار پلي اتيلن براي رنگ آميزي نقره استفاده مي شود. ظروف پلاستيکي هرچند ارزانتر هستند ولي تميز کردن آنها سخت تر است. همچنين بسيار بايد مراقب بود که خراشيده نشوند چراکه اين خراشها مخزن نقره خواهند شد و در رنگ آميزي اختلال ايجاد خواهند کرد. باقيمانده نقره را به سادگي مي توان از اين ظروف پلاستيکي توسط يک پارچه نرم آغشته به اتانل پاک کرد. اگر اين روش کافي نبود مي توان با محلول احيا کننده Farmer رنگ را به سادگي پاک نمود. ترکيبات اين محلول عبارتند از : 1/0 درصد کربنات سديم ، 3/0 درصد هگزاسيانوفرات[III] پتاسيم، و 6/0 درصد تيوسولفات سديم . در انتها شستن جعبه با آب و اتانل اين پروسه را کامل مي کند.
مواد مورد استفاده در اين روش بطور کلي بايد داراي رتبه استاندارد pro-analysis باشند:
آب بايد بوسيله رزين هاي تعويض يوني خالص شده باشد و با داشتن مقاومت بيشتر از پانزده مگااهم بر سانتيمتر (>15MΩ/cm) داراي کيفيت مناسب باشد. استفاده از آب مقطر مي تواندهمراه با نتايج غيرقابل پيش بيني باشد.
از محلول 40%-37 فرمالدئيد استفاده مي شود. اين محلول در دماي اتاق تا ماه ها پايدار است. نگهداري اين محلول در دماي 4 درجه سانتيگراد منجر به پليمريزه شدن و رسوب آن مي شود.
تيوسولفات سديم بصورت محلول 10% وزن به حجم (w/v) پنتاهيدراتِ تيوسولفات سديم در آب مورد استفاده قرارمي گيرد. مقادير کمي از اين محلول مثلاً 10 ميلي ليتر، بصورت هفتگي تهيه و در دماي اتاق نگهداري مي شود.
گلوتارآلدئيد : بصورت محلول 50% خريداري ميشود و در دماي 4 درجه سانتيگراد تا ماه ها نگهداري مي شود. گلوتارآلدئيد مورد استفاده بايد از کيفيت خوبي برخوردار باشد اما درهرحال استفاده از نوع Microscopy-grade آن لزومي ندارد. از محلول هاي زرد رنگ آن نبايد استفاده کرد.
اتانل 95% را مي توان بدون هيچ محاسبه حجم بکار برد و نيز نيازي به اتانل خالص نيست. استفاده از الکل هاي تقليبي (denatured) توصيه نمي شود.
محلول2 مولار اسيدسيتريک را مي توان تهيه و تا ماه ها در دماي اتاق نگهداري کرد.
محلول استات پتاسيم : غلظت 5 مولار تا ماهها در دماي اتاق قابل نگهداري است.
محلول يک نرمال نيترات نقره (Fluka) از پودر آن ارزانتر است و تا ماهها در يک ظرف تيره در يخچال قابل نگهداري است.
محلول يک نرمال هيدروکسيدسديم به کار مي رود.
محلول 5 نرمال هيدروکسيد آمونيوم را مي توان تهيه و در يخچال نگهداري کرد.
براي رنگ آميزي هر ژل ، حجم محلول مورد استفاده در هر مرحله بايد حداقل پنج برابر حجم ژل باشدبه طوريکه محلول کاملا" ژل را بپوشاند. تعدادي از پروتکلهايي که مي توانند مورد استفاده قرار بگيرند در ذيل ملاحظه مي شوند
6-3-1-1- رنگ آميزي نقره آمونياکي
محلول فيکساسيون که عبارتست از 25% حجمي اتانل و 4% حجمي فرمالدئيد.
محلول حساس کننده حاوي 05/0 درصد (w/v) 2-7 نفتالن دي سولفات دي سديم محلول نقره آمونياکي که به اين صورت تهيه مي شود: 480 ميلي ليتر آب درون يک فلاسک ريخته مي شود و با همزن مغناطيسي شديدا" مخلوط مي شود.. سپس به آن به ترتيب 5/7 ميلي ليتر محلول يک نرمال هيدروکسيد سديم ، 5/7 ميلي ليتر محلول 5 نرمال هيدروکسيد آمونيوم و 12 ميلي ليتر محلول يک نرمال نيترات نقره افزوده مي شود. درحين افزودن محلول نيترات نقره يک رسوب قهوه اي بطور گذرا پديدار مي شود که بايد ظرف چند ثانيه ناپديد شود. محلول مورد استفاده بايد کاملاً شفاف باشد. اين محلول براي رنگ آميزي 4 ژل کوچک کافي است.
محلول ظهور حاوي يک ميلي ليتر محلول 37% فرمالدئيد و 180 ميکروليتر اسيد سيتريک2 مولار در يک ليتر مي باشد .
محلول توقف حاوي بيست ميلي ليتر اسيداستيک و 5 ميلي ليتر اتانل آمين در ليتر است.
اين روش مبني بر روش Eschenbruch و Bürk است که در کليات آن تغييراتي ايجاد شده است. براي حصول نتايج مطلوب تغييراتي بايد در سطح قالب ريزي ژل ايجاد شود. بدين ترتيب که بجاي استفاده از بيس اکريلاميد از پيپرازين دي اکريلاميد (PDA) استفاده مي شود. همچنين تيوسولفات نيز در مرحله پليمريزاسيون به ژل افزوده مي شود. درعمل ، سيستم آغازگر متشکل از يک ميکروليتر TEMED، 10ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم و 10 ميکروليتر محلول 10% پرسولفات آمونيوم به ازاي هرميلي ليتر از مخلوط ژل مي باشد. اين مقادير متضمن شکل گيري صحيح ژل و حداقل رنگ زمينه درطي رنگ آميزي مي باشد.
بعد از الکتروفورز ، روش رنگ آميزي نقره به شرح زير انجام مي شود :
قالب ژل را بازکنيد و ژل را 5 تا 10 دقيقه در آب بشوييد.
ژل را يک ساعت درمحلول فيکس کننده قراردهيد
دو مرحله پانزده دقيقه اي ژل را درآب بشوييد.
ژل را در محلول حساس کننده از شب تا صبح قراردهيد.
شش مرحله بيست دقيقه درآب بشوييد.
درمحلول نقره آمونياکي بمدت 30 تا 60 دقيقه قراردهيد.
شش تا بيست دقيقه در آب بشوييد.
ژل را درمحلول ظهور ظاهر کنيد.
ظهور را با محلول توقف خاتمه دهيد. ژل را نيم تا يک ساعت در اين محلول قرار دهيد.
پيش از خشک کردن يا دانستيومتري ، ژل را چندبار با آب بشوييد.
6-3-1-2- محلول هاي مورد نياز براي روش رنگ آميزي نقره سريع :
محلول فيکس : 5% اسيداستيک ، 30% اتانل
محلول حساس کننده : 2 ميلي ليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول نقره : 7/0 ميلي ليتر محلول 37% فرمالدئيد و 5/12 ميلي ليتر محلول يک نرمال نيترات نقره در ليتر.
محلول ظهور : 30گرم کربنات پتاسيم خشک ، 250 ميکروليتر محلول 37% فرمالدئيد و 125 ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول توقف : 40گرم تريس و 20 ميلي ليتر اسيداستيک در ليتر.
اين پروتکل براساس روش Blum و همکاران که در آن تغييراتي داده شده است, انجام مي شود.
ژل را 3 تا 30 دقيقه درمحلول فيکس کننده قراردهيد.
ژل را با آب 2 بار و هر مرتبه 10 دقيقه بشوييد.
براي حساس کردن ژل آنرا يک دقيقه درمحلول حساس کننده قرار دهيد.
1 دقيقه در آب قرار دهيد.
حداقل 30 دقيقه در محلول نقره قراردهيد.
ژل را 5 الي 15 ثانيه در آب بشوييد.
تصوير را درمحلول ظهور ظاهر کنيد. اين مرحله 10 الي20 دقيقه طول مي کشد .
ظهور را به مدت 30 الي 60 دقيقه با محلول توقف خاتمه دهيد.
ژل را پيش از خشک کردن يا دانسيتومتري چندبار با آب بشوييد.
6-3-1-3- رنگ آميزي نقره ژلهاي داراي فيلم نگهدارنده:
محلول فيکس : 5% اسيداستيک ، 30% اتانل
محلول حساس کننده : 5/0 مولار استات پتاسيم ، 5/0 درصد گلوتارالدئيد ، 25% اتانل و 3 گرم در ليتر تتراتيونات پتاسيم (نکته 10 و 11 را ببينيد).
محلول رنگ آميزي نقره : 5/0 ميلي ليتر فرمالدئيد 37% و 5/12 ميلي ليتر محلول نقره يک نرمال در يک ليتر محلول.
محلول ظهور : 30گرم کربنات پتاسيم خشک ، 250 ميکروليتر محلول 37% فرمالدئيد و 125 ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول توقف : 40گرم تريس و 20 ميلي ليتر اسيداستيک در ليتر.
در اين روش تنها در هر ظرف مي توان يک ژل را رنگ آميزي کرد.
ژل را فيکس کنيد (3*30 دقیقه).
ژل را 30 الي 60 دقيقه درمحلول حساس کننده قراردهيد .
در آب بشوييد (15 * 4 دقيقه ).
بمدت 5 الي 10 ثانيه با آب بشوييد ( نکته 8 را ببينيد).
با استفاده از محلول توقف ظهور بمدت 30 الي 60 دقيقه ظهور را متوقف کنيد.
پيش از خشک کردن يا دانسيتومتري از ژل چندبار آنرا در آب بشوييد.
نکته ها :
تفاوت در پروتکل هاي مختلف رنگ آميزي نقره يا مربوط به زمان هرمرحله و يا در ترکيب محلولهاي هرمرحله هستند. تغييرات عمده در ارتباط با غلظت معرف نقره، يا ماهيت و غلظت محلول حساس کننده مي باشند. تنها موارد معدودي از مقايسه پروتکل هاي رنگ آميزي نقره منتشر شده اند . از ميان اين مقايسات ، پروتوکل هاي منتخب در بخشهاي قبلي ارائه شدند. انتخاب يک پروتوکل به امکانات آزمايشگاهي يک آزمايش و نيز به نيازهاي آزمايشگر (سرعت ، قابليت تکرار و غيره ) بستگي دارد. رهنمود هاي زير را مي توان در اين رابطه پيشنهاد کرد :
حداکثر حساسيت از يک روش به روش ديگر تفاوت گسترده اي ندارد. تفاوتها اصلي در يکنواختي رنگ آميزي از يک پروتئين به پروتئين ديگر ، قابليت تکرار در رنگ آميزي ، سرعت روش، و انطباق آن بر پروتکل هاي مختلف 2-D است.
بطور کلي، روشهايي که در آنها از نقره آمونياکي استفاده ميشود نتايج بسيار يکساني بدست مي دهند و آثار رنگي (Color Effects) آن حداقل هستند و بنابراين براي ژلهاي 2-D که در آنها از محدوده وسيع pH استفاده مي شود بسيار توصيه مي شوند. با اين وجود ، اين روشها داراي نقصهاي کوچکي هستند که مانع استفاده عمومي آنها مي شود.
معرف نقره نسبت به غلظت آمونياک بسيار حساس است. از آنجا که آمونياک بسيار فرار است باعث مشکلاتي در تکرار پذيري اين روش در طي زمان مي شود. با استفاده از محلولهاي آمونياک تيترشده تجارتي مي توان تا حدود زيادي اين مشکلات را برطرف نمود.
نقره آمونياکي با تمام سيستم هاي ژلهاي SDS سازگار نيست. سيستم هايي که در آنها از Tricine يا Bicine بعنوان يون دنبال کننده استفاده مي شود با رنگ آميزي نقره آمونياکي سازگار نيستند.
رنگ آميزي نقره آمونياکي براي ژلهايي که فيلم نگهدارنده دارند توصيه نمي شود. در چنين مواردي آينه هاي نقره اي در ژل مکرراً مشاهده مي شود.
پروتکل هاي مناسب براي رنگ آميزي نقره آمونياکي عموماً زمانبر هستند. بعلاوه ، با استفاده از ژلهاي دست ساز ( غيرخريداري ) که در آنها از PDA بعنوان اتصال جانبي و نيز از تيوسولفات در مرحله پليمريزاسيون استفاده شده است نتايج مطلوب تري بدست مي آيد. اين موضوع مانع استفاده از ژلهاي تجارتي مي شود. بعلاوه اين پروتوکلها زماني بهترين نتايج را بدست مي دهند که از آلدئيدها ( فرمالدئيد يا گلوتارالدئيد ) بعنوان فيکس کننده و يا حساس کننده استفاده شود. ولي اين مواد مانع از بازيافت پروتئين هاي رنگ آميزي شده با نقره براي استفاده هاي بعدي مثلاً در Mass Spectrometry مي شود.
6-4- رنگ آميزي فلئورسانس
رنگ آميزي با رنگ هاي فلئورسانت, نظير SYPRO Ruby روشي بهينه شده براي آشکارسازي پروتئين ها در الکتروفورز دو بعدي است. اين رنگها با تجارب مربوط به پروتئوميکس بسيار سازگار هستند. حساسيت رنگ SYPRO Ruby قابل مقايسه با رنگ اميزي نقره است و بر خلاف نيترات نقره داراي محدوده ي ديناميکي گسترده اي است. به همين دليل امکان تعيين کميت و اندازه گيري دقيق را مي دهد. رنگ آميزي با SYPRO Ruby با روشهاي طيف سنجي جرمي نيز سازگار است.
تغييري هوشمندانه در الکتروفورز دوبعدي با استفاده از رنگ هاي فلئورسانس موجب ابداع روشي جديد به نام الکتروفورز ژل افتراقي[3] يا DIGE شده است. در اين روش پروتئين ها در هر يک از دو نمونه مورد مقايسه با رنگ فلئورسانس متفاوتي برچسب گذاري مي شوند. سپُ آنها بر روي يک ژل تفکيک مي شوندو با آشکارسازي تفاوت بين دو نمونه مورد مقايسه قرار مي گيرد. از اين طريق اختلاف ناشي از استفاده از ژل هاي متعدد از بين مي رود.
__________________
رنگ آميزي با رنگهاي آنيونيك نظير كوماسي بلو
رنگ آميزي منفي با كاتيونهاي فلزي مثل رنگ آميزي زينك يا روي
رنگ آميزي Silver يا نقره
فلورسانس
ايزوتوپهاي راديواكتيو با استفاده از اتوراديوگرافي ، فلوروگرافي يا فسفرو ايميجينگ
در اغلب اين روشهاي رنگ آميزي پلي پپتيد هاي تفكيك شده بايد حداقل چند ساعت درمحلولي حاوي اتانول, استيك اسيد و آب تثبيت شوند.
6-1- رنگ آميزي آبي کوماسي و ايميدازول
روش انتخابي برای رنگ آميزی ژل پس از انجام 2D-PAGE بستگی به طبيعت نمونه اوليه و هدف آزمايش دارد. برای شناسايی پروتئين ها با استفاده از ژل های Preparative و طيف سنجی جرمی يک روش رنگ آميزی قابل برگشت مورد نياز است. رنگ آميزی ژل پلی آکريل آميد با آبی کوماسی يا ايميدازول – روی نتايج مطلوبی بدست می دهد که با روشهای طيف سنجی جرمی سازگار است
آبی کوماسی اساساً اولين بار براي رنگ آميزی اسيدی پشم تهيه شد. دو گونه ي مختلف از اين رنگ وجود دارد که به نامهای آبی کوماسی G-250 و R-250 شناخته می شوند و به ترتيب دارای ته رنگ سبز و قرمز هستند. عدد 250 نيز معرف قدرت رنگ است که اولين بار توسط توليد کنندة آن Imperial Chemical Industries مورد استفاه قرارگرفت. اگر چه اين شرکت ديگر رنگ را توليد نمی کند ولی علامت تجاری اين محصول به آن تعلق دارد. روش رنگ آميزی رايج ژلهای پلی آکريل آميد با آبی کوماسی که در ترکيب با اسيد استيک و متانل بکار مي رود، سالهاست که مورد استفاده قرار می گيرد. رنگ کوماسی آبی G-250 با اسيدهای آمينه قليايی از جمله آرژی نين ، تيروزين ، ليزين و هيستيدين ايجاد کمپلکس می کند. اما رنگ شديد زمينه و متعاقب آن نياز به مراحل متعدد رنگ زدايی از نکات منفي اين روش است.
روش رنگ آميزی ايميدازول - روی که توسط Ortiz و همکارانش ابداع شد يک روش رنگ آميزی نگاتيو است که در آن زمينه ي ژل به جاي پروتئين ها رنگ می شود. در اين روش در مناطقی از ژل که حاوی پروتئين نيستند, کمپلکسي از "SDS" و ايميدازول روی رسوب ميکنند, که يک زمينه ي سفيد کدر روی ژل ايجاد می کند. مناطقی از ژل که حاوی پروتئين هستند شفاف باقی می مانند. اين روش رنگ آميزی به حساسيت روش نقره است و تنها نيم ساعت طول می کشد. علاوه بر اين ، نيازی به تثبيت پروتئين ها در ژل وجود ندارد. برهم کنشی بين رنگ و پروتئين وجود ندارد ودر صورت نياز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدايی کرد. در اينجا هر دو روش شرح داده می شود . اين روشها را برای ژلهای 2-D آناليتيکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد. برای ژلهای نازک تر ( کمتر از يک ميلی متر ) زمان انکوباسيون در روش ايميدازول- روی را می توان کاهش داد.
همة محلولها بايد در ظروف شيشه ای و با آب مقطر ديونيزه تهيه شوند. محلولهای رنگ آميزی آبی کوماسی G-250 عبارتند از محلول تثبيت کننده و محلول رنگ آبی کوماسی G-250. محلول های روش رنگ آميزی منفی ايميدازول-روی عبارتند از محلول کربنات سديم، محلول ايميدازول SDS ،محلول استات روی. هرگونه ذرات معلق بايد توسط کاغذ ----- Whatman شماره 1 صاف شود. در اين روش ها تمام محلول ها و ژلها بايد با دستکش کار شوند و تمام مراحل کار در دمای اتاق و در ظروف رنگ آميزی و روی شيکر[1] انجام شود.
در روش رنگ آميزی با آبی کوماسی G-250, تثبيت ژل بلافاصله پس از الکتروفورز انجام می شود. با اين وجود بايد توجه داشت که مرحله تثبيت کردن در اين روش رنگ آميزی يک ضرورت نيست.
مرحله تثبيت ژل در روش ايميدازول-روی ضروری نيست و ژلها بلافاصله پس از الکتروفورز رنگ آميزی می شوند. برای مشاهده ي بهتر، رنگ آميزی ژل در يک زمينه تيره برای تشخيص نحوه ي ظهور رنگ ايده آل خواهد بود. هنگامی که وضوح مطلوب بر روی ژل مشاهده شد پروتئين ها بصورت مناطق شفاف در يک زمينة مات سفيد خود را نشان می دهند.
نکته ها :
رنگ آميزی با آبی کوماسی R-250 با روشهای طيف سنجی جرمی سازگاراست.
تفاوتهايی در حساسيت و زمان رنگ آميزی روشهای شرح داده شدة فوق وجود دارد. تجربه نشان داده است که حساسيت روش رنگ آميزی ايميدازول روی به اندازة روش نقره است (10-1 نانوگرم BSA ) و حدود نيم ساعت طول می کشد. در بين روشهای فوق ، روش رنگ آميزی منفی از همه سريعتر و حساستر است. اما اين ژلها اندکی شکننده تر بنظر مي رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نياز به زمينة تيره دارند. روش استاندارد کوماسی R-250 از بقيه حساسيت کمتری دارد و الکل زيادی نيز مصرف می کند.
اگر با ژل ها با ملايمت رفتار نشود ترک می خورند و می شکنند. اگر چنين اتفاقاتی برای ژل زياد روی می دهد اکريل آميد را با دورآکريل[2] جايگزين کنيد.
ظرف رنگ آميزی بايد به گونه ای انتخاب شود که اندکی بزرگتر از ژل باشد. ژلها به ويژه ژلهای بزرگ، بايد در ظروف جداگانه رنگ آميزی شوند. ظروف پلاستيکی مناسب برای رنگ آميزی ارجحيت دارند اما ظروف شيشه ای نيز مناسب هستند .
طيف سنجی پپتيدی و طيف مربوط به ترادف پپتيدها را با کيفيت خوبی می توان از پروتئين بدست آمده از يک الی چهار نقطه بدست آمده از ژلهای مشابهی که با هرکدام از روشهای رنگ آميزی گفته شده در اين بخش رنگ شده باشند بدست آورد. آبی کوماسی را می توان در طی هضم داخل ژل توسط تريپسين، با کمک حلالهای آلی از بين برد. تکه ژلهايی که توسط ايميدازول- روی رنگ آميزی شده اند را می توان پيش از قراردادن در معرض تريپسين، توسط اسيد سيتريک 2% رنگ زدايی کرد. البته اين کار ضروری نيست . بايد توجه نمود که رنگ آميزی نقره نيز با اعمال تغييراتی می تواند با طيف سنجی جرمی سازگار شوند.
6-2- روش رنگ آميزی کوماسی کلوئيدی:
در سال 1985 Neuhoff روشی حساس برای رنگ آميزی پروتئين در ژلهای آکريلاميد بر پاية ويژگی کلوئيدی آبی کوماسی G-250 ارائه کرد. اين روش درکمتر از يک ساعت پروتئين ها را در يک زمينه تميز و با حساسيتی درحدود روش نقره رنگ آميزی می کند. اين روش بعداً توسط همان گروه بهبود يافت.
افزودن متانل و سولفات آمونيوم به محلولی از آبی کوماسی G-250 در اسيد فسفريک رقيق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئيدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آميزی، تعادلی بين اشکال کلوئيدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد. فرم پراکنده رنگ وارد ماتريکس ژل می شود و پروتئين ها را رنگ می کند. حال آنکه فرم کلوئيدی بيرون نگه داشته می شود و به اين ترتيب از رنگ آميزی زمينه پرهيز می شود.
پروتکل های متعددی برای رنگ آميزی با کوماسی و نيز تعداد مختلفی رنگ کوماسی وجود دارد. اين روشها سريع و ارزان هستند هرچند که مرحله تهيه رنگ می تواند اندکی همراه با آلودگی با رنگ باشد. بهتر است محلول رنگ را به فواصل زمانی مشخصی تجديد کرد چون رنگ کهنه حساسيت خود را از دست می دهد. همچنين می توان محلولهای آماده رنگ را البته با قيمت بيشتر خريداری کرد. اغلب شرکتهايی که اين رنگها را توليد می کنند ادعا می کنند که اين رنگها از رنگهای کوماسی مرسوم حساستر هستند و رنگ زدايی کمتر احتياج دارند و بعلاوه ، مواد غير پروتئينی از جمله پلی ساکاريدها را هم رنگ می کند.
تمام مراحل کار روی يک شيکر چرخان با دور ملايم انجام می شوند. بدنبال الکتروفورز، ژل را در محلول رنگ کوماسی کلوئيدی قرار می گيرد. محلول رنگ را پيش از استفاده نبايد صاف کرد. ژل حدود 6 ساعت يا شب تا صبح درمحلول رنگ قرار داده می شود. در انتها ژل چندين بار با آب مقطر شسته می شود تا زمينة ژل شفاف شود .
6-3- رنگ آميزي نيترات نقره
رنگ آميزي نقره ژلهاي پلي آکريل آميد اولين بار در سال 1979 توسط Switzer و همکارانش، معرفي شد، و به دليل حساسيت بالاي آن به سرعت عموميت پيدا کرد. حساسيت اين روش حدودا" صد بار بيشتر از روش رنگ آميزي با آبي کوماسي است. با اين وجود، دستورالعمل هاي اوليه رنگ آميزي نقره خالي از اشکال نبودندو رنگهاي پس زمينه روي ژل و متعاقباً کاهش حساسيت و کاهش تکرارپذيري مکرراً تجربه مي شد.
اين موضوع منجر شد به اينکه بسياري از نويسندگان پروتوکل هاي اصلاح شده اي را پيشنهاد کنند بنحوي که امروزه بيش از يکصد پروتوکل مختلف براي رنگ آميزي نقره در منابع علمي يافت مي شود. با اين وجود ، تمام اين روشها بر پايه اصول مشترکي قرار دارند
مرحله اول عبارتست از تثبيت يا fixation و هدف آن غيرمحلول نمودن پروتئين ها در درون ژل و نيز شستن ترکيبات تداخل کننده اي است که در ژلهاي 2-D وجود دارند, از جمله گلايسين ، تريس ، SDS و کريرآمفولايت هايي که در ته ژلها وجود دارند.
مرحله دوم حساس نمودن است و هدف از اين مرحله افزايش دادن امکان ظهور نقاط در مراحل بعدي است. ترکيبات بي شماري براي اين منظور پيشنهاد شده اند. تمام اين ترکيبات به پروتئين ها متصل مي شوند و همچنين قادرند که به يون نقره متصل شوند و يا اينکه يون نقره را به نقره فلزي يا سولفيد نقره تبديل کنند. مرحله حساس نمودن گاهي با مرحله فيکس کردن همزمان انجام مي شود.
مرحله سوم اضافه کردن نقره است که در اين مرحله مي توان از نيترات نقره ساده يا نقره آمونياکي استفاده کرد.
مرحله چهارم و آخر عبارتست از ظهور ژلهايي که در نيترات نقره غوطه ور بوده اند. محلول ظهور حاوي فرم آلدئيد ، کربنات و تيوسولفات است. استفاده از ترکيب اخير که توسط Blum و همکاران معرفي شده است باعث کاهش قابل ملاحظه اي در پس زمينه و نيز ظهور کامل تصوير مي شود. در ژلهايي که در محلول نقره آمونياکي بوده اند محلول ظهور بايد حاوي فرمالدئيد و اسيدسيتريک باشد. براي کاهش رنگ زمينه همچنين مي توان ژل را پيش از مرحله ظهور مختصراً در تيوسولفات قرار داد يا اينکه آنرا درمحلول ظهور لحاظ کرد. زماني که حدمطلوب ظهور تصوير بدست آمد، با قراردادن ژن در محلول متوقف کننده از ادامه ظهور جلوگيري مي شود. اين محلول عموماً محتوي اسيداستيک و يک آمين است که pH آنرا به 7 برساند. تثبيت نهايي تصوير ژل با شستن کامل آن در آب بدست مي آيد.
عموما" از ظروف شيشه اي يا ظروف دردار پلي اتيلن براي رنگ آميزي نقره استفاده مي شود. ظروف پلاستيکي هرچند ارزانتر هستند ولي تميز کردن آنها سخت تر است. همچنين بسيار بايد مراقب بود که خراشيده نشوند چراکه اين خراشها مخزن نقره خواهند شد و در رنگ آميزي اختلال ايجاد خواهند کرد. باقيمانده نقره را به سادگي مي توان از اين ظروف پلاستيکي توسط يک پارچه نرم آغشته به اتانل پاک کرد. اگر اين روش کافي نبود مي توان با محلول احيا کننده Farmer رنگ را به سادگي پاک نمود. ترکيبات اين محلول عبارتند از : 1/0 درصد کربنات سديم ، 3/0 درصد هگزاسيانوفرات[III] پتاسيم، و 6/0 درصد تيوسولفات سديم . در انتها شستن جعبه با آب و اتانل اين پروسه را کامل مي کند.
مواد مورد استفاده در اين روش بطور کلي بايد داراي رتبه استاندارد pro-analysis باشند:
آب بايد بوسيله رزين هاي تعويض يوني خالص شده باشد و با داشتن مقاومت بيشتر از پانزده مگااهم بر سانتيمتر (>15MΩ/cm) داراي کيفيت مناسب باشد. استفاده از آب مقطر مي تواندهمراه با نتايج غيرقابل پيش بيني باشد.
از محلول 40%-37 فرمالدئيد استفاده مي شود. اين محلول در دماي اتاق تا ماه ها پايدار است. نگهداري اين محلول در دماي 4 درجه سانتيگراد منجر به پليمريزه شدن و رسوب آن مي شود.
تيوسولفات سديم بصورت محلول 10% وزن به حجم (w/v) پنتاهيدراتِ تيوسولفات سديم در آب مورد استفاده قرارمي گيرد. مقادير کمي از اين محلول مثلاً 10 ميلي ليتر، بصورت هفتگي تهيه و در دماي اتاق نگهداري مي شود.
گلوتارآلدئيد : بصورت محلول 50% خريداري ميشود و در دماي 4 درجه سانتيگراد تا ماه ها نگهداري مي شود. گلوتارآلدئيد مورد استفاده بايد از کيفيت خوبي برخوردار باشد اما درهرحال استفاده از نوع Microscopy-grade آن لزومي ندارد. از محلول هاي زرد رنگ آن نبايد استفاده کرد.
اتانل 95% را مي توان بدون هيچ محاسبه حجم بکار برد و نيز نيازي به اتانل خالص نيست. استفاده از الکل هاي تقليبي (denatured) توصيه نمي شود.
محلول2 مولار اسيدسيتريک را مي توان تهيه و تا ماه ها در دماي اتاق نگهداري کرد.
محلول استات پتاسيم : غلظت 5 مولار تا ماهها در دماي اتاق قابل نگهداري است.
محلول يک نرمال نيترات نقره (Fluka) از پودر آن ارزانتر است و تا ماهها در يک ظرف تيره در يخچال قابل نگهداري است.
محلول يک نرمال هيدروکسيدسديم به کار مي رود.
محلول 5 نرمال هيدروکسيد آمونيوم را مي توان تهيه و در يخچال نگهداري کرد.
براي رنگ آميزي هر ژل ، حجم محلول مورد استفاده در هر مرحله بايد حداقل پنج برابر حجم ژل باشدبه طوريکه محلول کاملا" ژل را بپوشاند. تعدادي از پروتکلهايي که مي توانند مورد استفاده قرار بگيرند در ذيل ملاحظه مي شوند
6-3-1-1- رنگ آميزي نقره آمونياکي
محلول فيکساسيون که عبارتست از 25% حجمي اتانل و 4% حجمي فرمالدئيد.
محلول حساس کننده حاوي 05/0 درصد (w/v) 2-7 نفتالن دي سولفات دي سديم محلول نقره آمونياکي که به اين صورت تهيه مي شود: 480 ميلي ليتر آب درون يک فلاسک ريخته مي شود و با همزن مغناطيسي شديدا" مخلوط مي شود.. سپس به آن به ترتيب 5/7 ميلي ليتر محلول يک نرمال هيدروکسيد سديم ، 5/7 ميلي ليتر محلول 5 نرمال هيدروکسيد آمونيوم و 12 ميلي ليتر محلول يک نرمال نيترات نقره افزوده مي شود. درحين افزودن محلول نيترات نقره يک رسوب قهوه اي بطور گذرا پديدار مي شود که بايد ظرف چند ثانيه ناپديد شود. محلول مورد استفاده بايد کاملاً شفاف باشد. اين محلول براي رنگ آميزي 4 ژل کوچک کافي است.
محلول ظهور حاوي يک ميلي ليتر محلول 37% فرمالدئيد و 180 ميکروليتر اسيد سيتريک2 مولار در يک ليتر مي باشد .
محلول توقف حاوي بيست ميلي ليتر اسيداستيک و 5 ميلي ليتر اتانل آمين در ليتر است.
اين روش مبني بر روش Eschenbruch و Bürk است که در کليات آن تغييراتي ايجاد شده است. براي حصول نتايج مطلوب تغييراتي بايد در سطح قالب ريزي ژل ايجاد شود. بدين ترتيب که بجاي استفاده از بيس اکريلاميد از پيپرازين دي اکريلاميد (PDA) استفاده مي شود. همچنين تيوسولفات نيز در مرحله پليمريزاسيون به ژل افزوده مي شود. درعمل ، سيستم آغازگر متشکل از يک ميکروليتر TEMED، 10ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم و 10 ميکروليتر محلول 10% پرسولفات آمونيوم به ازاي هرميلي ليتر از مخلوط ژل مي باشد. اين مقادير متضمن شکل گيري صحيح ژل و حداقل رنگ زمينه درطي رنگ آميزي مي باشد.
بعد از الکتروفورز ، روش رنگ آميزي نقره به شرح زير انجام مي شود :
قالب ژل را بازکنيد و ژل را 5 تا 10 دقيقه در آب بشوييد.
ژل را يک ساعت درمحلول فيکس کننده قراردهيد
دو مرحله پانزده دقيقه اي ژل را درآب بشوييد.
ژل را در محلول حساس کننده از شب تا صبح قراردهيد.
شش مرحله بيست دقيقه درآب بشوييد.
درمحلول نقره آمونياکي بمدت 30 تا 60 دقيقه قراردهيد.
شش تا بيست دقيقه در آب بشوييد.
ژل را درمحلول ظهور ظاهر کنيد.
ظهور را با محلول توقف خاتمه دهيد. ژل را نيم تا يک ساعت در اين محلول قرار دهيد.
پيش از خشک کردن يا دانستيومتري ، ژل را چندبار با آب بشوييد.
6-3-1-2- محلول هاي مورد نياز براي روش رنگ آميزي نقره سريع :
محلول فيکس : 5% اسيداستيک ، 30% اتانل
محلول حساس کننده : 2 ميلي ليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول نقره : 7/0 ميلي ليتر محلول 37% فرمالدئيد و 5/12 ميلي ليتر محلول يک نرمال نيترات نقره در ليتر.
محلول ظهور : 30گرم کربنات پتاسيم خشک ، 250 ميکروليتر محلول 37% فرمالدئيد و 125 ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول توقف : 40گرم تريس و 20 ميلي ليتر اسيداستيک در ليتر.
اين پروتکل براساس روش Blum و همکاران که در آن تغييراتي داده شده است, انجام مي شود.
ژل را 3 تا 30 دقيقه درمحلول فيکس کننده قراردهيد.
ژل را با آب 2 بار و هر مرتبه 10 دقيقه بشوييد.
براي حساس کردن ژل آنرا يک دقيقه درمحلول حساس کننده قرار دهيد.
1 دقيقه در آب قرار دهيد.
حداقل 30 دقيقه در محلول نقره قراردهيد.
ژل را 5 الي 15 ثانيه در آب بشوييد.
تصوير را درمحلول ظهور ظاهر کنيد. اين مرحله 10 الي20 دقيقه طول مي کشد .
ظهور را به مدت 30 الي 60 دقيقه با محلول توقف خاتمه دهيد.
ژل را پيش از خشک کردن يا دانسيتومتري چندبار با آب بشوييد.
6-3-1-3- رنگ آميزي نقره ژلهاي داراي فيلم نگهدارنده:
محلول فيکس : 5% اسيداستيک ، 30% اتانل
محلول حساس کننده : 5/0 مولار استات پتاسيم ، 5/0 درصد گلوتارالدئيد ، 25% اتانل و 3 گرم در ليتر تتراتيونات پتاسيم (نکته 10 و 11 را ببينيد).
محلول رنگ آميزي نقره : 5/0 ميلي ليتر فرمالدئيد 37% و 5/12 ميلي ليتر محلول نقره يک نرمال در يک ليتر محلول.
محلول ظهور : 30گرم کربنات پتاسيم خشک ، 250 ميکروليتر محلول 37% فرمالدئيد و 125 ميکروليتر محلول 10% تيوسولفات سديم در ليتر.
محلول توقف : 40گرم تريس و 20 ميلي ليتر اسيداستيک در ليتر.
در اين روش تنها در هر ظرف مي توان يک ژل را رنگ آميزي کرد.
ژل را فيکس کنيد (3*30 دقیقه).
ژل را 30 الي 60 دقيقه درمحلول حساس کننده قراردهيد .
در آب بشوييد (15 * 4 دقيقه ).
بمدت 5 الي 10 ثانيه با آب بشوييد ( نکته 8 را ببينيد).
با استفاده از محلول توقف ظهور بمدت 30 الي 60 دقيقه ظهور را متوقف کنيد.
پيش از خشک کردن يا دانسيتومتري از ژل چندبار آنرا در آب بشوييد.
نکته ها :
تفاوت در پروتکل هاي مختلف رنگ آميزي نقره يا مربوط به زمان هرمرحله و يا در ترکيب محلولهاي هرمرحله هستند. تغييرات عمده در ارتباط با غلظت معرف نقره، يا ماهيت و غلظت محلول حساس کننده مي باشند. تنها موارد معدودي از مقايسه پروتکل هاي رنگ آميزي نقره منتشر شده اند . از ميان اين مقايسات ، پروتوکل هاي منتخب در بخشهاي قبلي ارائه شدند. انتخاب يک پروتوکل به امکانات آزمايشگاهي يک آزمايش و نيز به نيازهاي آزمايشگر (سرعت ، قابليت تکرار و غيره ) بستگي دارد. رهنمود هاي زير را مي توان در اين رابطه پيشنهاد کرد :
حداکثر حساسيت از يک روش به روش ديگر تفاوت گسترده اي ندارد. تفاوتها اصلي در يکنواختي رنگ آميزي از يک پروتئين به پروتئين ديگر ، قابليت تکرار در رنگ آميزي ، سرعت روش، و انطباق آن بر پروتکل هاي مختلف 2-D است.
بطور کلي، روشهايي که در آنها از نقره آمونياکي استفاده ميشود نتايج بسيار يکساني بدست مي دهند و آثار رنگي (Color Effects) آن حداقل هستند و بنابراين براي ژلهاي 2-D که در آنها از محدوده وسيع pH استفاده مي شود بسيار توصيه مي شوند. با اين وجود ، اين روشها داراي نقصهاي کوچکي هستند که مانع استفاده عمومي آنها مي شود.
معرف نقره نسبت به غلظت آمونياک بسيار حساس است. از آنجا که آمونياک بسيار فرار است باعث مشکلاتي در تکرار پذيري اين روش در طي زمان مي شود. با استفاده از محلولهاي آمونياک تيترشده تجارتي مي توان تا حدود زيادي اين مشکلات را برطرف نمود.
نقره آمونياکي با تمام سيستم هاي ژلهاي SDS سازگار نيست. سيستم هايي که در آنها از Tricine يا Bicine بعنوان يون دنبال کننده استفاده مي شود با رنگ آميزي نقره آمونياکي سازگار نيستند.
رنگ آميزي نقره آمونياکي براي ژلهايي که فيلم نگهدارنده دارند توصيه نمي شود. در چنين مواردي آينه هاي نقره اي در ژل مکرراً مشاهده مي شود.
پروتکل هاي مناسب براي رنگ آميزي نقره آمونياکي عموماً زمانبر هستند. بعلاوه ، با استفاده از ژلهاي دست ساز ( غيرخريداري ) که در آنها از PDA بعنوان اتصال جانبي و نيز از تيوسولفات در مرحله پليمريزاسيون استفاده شده است نتايج مطلوب تري بدست مي آيد. اين موضوع مانع استفاده از ژلهاي تجارتي مي شود. بعلاوه اين پروتوکلها زماني بهترين نتايج را بدست مي دهند که از آلدئيدها ( فرمالدئيد يا گلوتارالدئيد ) بعنوان فيکس کننده و يا حساس کننده استفاده شود. ولي اين مواد مانع از بازيافت پروتئين هاي رنگ آميزي شده با نقره براي استفاده هاي بعدي مثلاً در Mass Spectrometry مي شود.
6-4- رنگ آميزي فلئورسانس
رنگ آميزي با رنگ هاي فلئورسانت, نظير SYPRO Ruby روشي بهينه شده براي آشکارسازي پروتئين ها در الکتروفورز دو بعدي است. اين رنگها با تجارب مربوط به پروتئوميکس بسيار سازگار هستند. حساسيت رنگ SYPRO Ruby قابل مقايسه با رنگ اميزي نقره است و بر خلاف نيترات نقره داراي محدوده ي ديناميکي گسترده اي است. به همين دليل امکان تعيين کميت و اندازه گيري دقيق را مي دهد. رنگ آميزي با SYPRO Ruby با روشهاي طيف سنجي جرمي نيز سازگار است.
تغييري هوشمندانه در الکتروفورز دوبعدي با استفاده از رنگ هاي فلئورسانس موجب ابداع روشي جديد به نام الکتروفورز ژل افتراقي[3] يا DIGE شده است. در اين روش پروتئين ها در هر يک از دو نمونه مورد مقايسه با رنگ فلئورسانس متفاوتي برچسب گذاري مي شوند. سپُ آنها بر روي يک ژل تفکيک مي شوندو با آشکارسازي تفاوت بين دو نمونه مورد مقايسه قرار مي گيرد. از اين طريق اختلاف ناشي از استفاده از ژل هاي متعدد از بين مي رود.
__________________