Borna66
04-10-2009, 04:50 PM
درحين ليزسلولي و بعد ازآن تركيبات تداخل كننده اي نظير آنزيمهاي پروتئولايتيك ، نمكها ، ليپيدها ، اسيدهاي نوكلئيك ، پلي ساكاريدها و فنل هاي گياهي بايد غيرفعال شده يا از نمونه تهيه شده خارج شوند.
در اين بخش به توضيح اين آلاينده ها و اثر آنها بر الکتروفورز دو بعدي پرداخته و روشهاي حذف آنها را شرح خواهيم داد.
3-3-3-1- پروتئازها
پروتئازهاي موجود و حاضر در نمونه بايد غيرفعال شوند تا از تخريب پروتئينها جلوگيري شود. درغير اينصورت پروتئازها با شکستن پروتئينها سبب پديدار شدن نقاط مصنوعي در نمايه دو بعدي مي شوند. روشهاي مختلفي براي مقابله با پروتئوليز ضمن آماده‌سازي نمونه وجود دارد, براي مثال استخراج پروتئين در pH بازي، جوشاندن نمونه در SDS ، و همچنين استفاده از مهاركننده‌هاي پروتئازها (PI) به تنهايي يا در تركيب با يکديگر.
مهارکننده هاي پروتئاز را مي توان به محلول ليز کننده افزود اما هميشه اين کار توصيه نمي شود, چراكه اين مواد ممكن است باعث ايجاد تغيير بار الکتريکی در پروتئينهای ديگر شده و سبب ايجاد نقاط مصنوعي شوند. راه حل هاي ديگر جوشاندن نمونه در بافري با pH بالا نظير بافر تريس است که داراي "SDS" باشد. براي غيرفعال كردن پروتئازها با pH پايين از رسوب دادن با "TCA" 20% بر روي يخ مي توان بهره جست.
اين نكته را بايد درنظر داشت كه غيرفعال سازي كامل تمام پروتئازها کاري بسيار سخت است. رسوب دهي توسط "TCA" و استن در كاهش تخريب پروتئينها و خارج ساختن تركيبات تداخل كننده معمولاً مفيد است. اما بايد كاملاً مراقب بود كه پروتئينها در اثر رسوب دادن ناقص و يا بعد از رسوب دادن, در حين محلول کردن دوباره، از دست نروند. نشان داده شده است که محلول‌هاي حاوي تيواوره 2 مولار و اوره 7 مولار كارآيي قابل توجهي در مهار پروتئينازهاي نمونه دارند. تيواوره علاوه بر مفيد بودن درحل كردن پروتئينها به عنوان يك مهاركننده قوي پروتئينازها نيز عمل مي کند.
3-3-3-2- اسيد هاي نوکلئيک
حضور اسيدهاي نوكلئيك نيز مي تواند درحين "IEF" مسئله ساز شود. اين امر ناشي از افزايش در ويسكوزيته ي نمونه و دربعضي از موارد ايجاد كمپلكسهايي با پروتئينهاي نمونه است كه منجر به مهاجرت غيرعادي و ايجاد رگه ها ي افقي و عمودي در نمايه ي ژل الکتروفورز دو بعدي مي شود. اگر مشكلاتي از اين قبيل بوجود آيد بهترين كار متلاشي كردن اسيدنوكلئيك با يك اندونوكلئاز خالص و مناسب و عاري از پروتئاز است. روش ديگر استفاده از توانايي آمفولايت ها در ايجاد كمپلكس با اسيدهاي نوكلئيك و بعد خارج كردن اين كمپلكس ها با اولترا سانتريفوژ است .
3-3-3-3- نمک ها
نمک ها با تغيير در رسانايي و قدرت عبور جريان الکتريکي در ژلهاي "IPG" باعٍث اختلال در "IEF" شده و تا زماني که يونهاي نمکها از انتهاي نوار هاي "IPG" خارج نشوند فوکوسينگ پروتئين ها محقق نخواهد شد, همين امر زمان فوکوسينگ را افزايش مي دهد. حضور نمک در نمونه, ممکن است باعث جابه جايي آب موجود در نوار"IPG" نيز شود, به طوريکه يک سمت ژل خشک و سمت ديگر متورم خواهد شد. از طرف ديگر وجود مقادير زياد نمک در نمونه باعث مي شود پروتئين ها در نواحي نسبتا" عريضي در دو انتهاي ژل فوکوس نشوند. به همين دلايل نمک اضافي موجود در نمونه ها يا بايد خارج شوند يا به کمترين حد ممکن تقليل داده شوند. همانطور که قبلا" اشاره شده است بايد غلظت نمک موجود درنمونه کمتر از 40 ميلي مولار باشد. زمانيکه نمونه در خيساندن ژل بار گيري مي شود بايد غلظت نمک کمتر از 10 ميلي مولار باشد.
براي نمک زدايي از روشهاي مختلفي مي توان استفاده کرد که رايجترين آنها استفاده از دياليز, تغليظ کننده هاي غشايي, ژل فيلتراسيون و رسوب دهي است. دياليز روشي بسيار کارآمد است که در آن کمترين مقدار از نمونه از دست داده ميشود. اما داراي روندي طولاني مدت است و احتيآج به حجم بالايي از محلول دارد. تغليظ کننده هاي غشايي يا دياليز همراه با سانتريفوژ سريعتر صورت ميگيرد, اما امکان اتصال پروتئين ها به غشا دياليز در اين روش بيشتر است. در ژل فيلتراسيون نيز امکان از دست رفتن پروتئين هاي نمونه زياد است.
3-3-3-4- روشهاي رسوبدهي
در روش هاي آماده سازي نمونه, رسوب دادن پروتئين ها به عنوان يک مرحله ي اختياري تلقي مي گردد. اين روش براي جدا کردن انتخابي پروتئين ها از مواد آلاينده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها, دترجنت ها, اسيد هاي نوکلئيک, و غيره به کار گرفته مي شود. از اين روش براي تغليظ پروتئين هاي موجود در يک نمونه که در حالت عادي بسيار رقيق باشند, نيز استفاده مي شود.
بايد توجه داشت که هيچ روش رسوب دهي به طور کامل کارآمد نيست و برخي از پروتئين ها بعد از رسوب داده شدن مجددا" محلول نمي شوند. به همين دليل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدي استفاده کردن از اين روش را در دستور کار مي توان قرار داد. در صورتيکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترين نمايه دو بعدي يک نمونه باشد, بايد از انجام رسوب دهي صرف نظر کرد.
در اين بخش به توضيح اين آلاينده ها و اثر آنها بر الکتروفورز دو بعدي پرداخته و روشهاي حذف آنها را شرح خواهيم داد.
3-3-3-1- پروتئازها
پروتئازهاي موجود و حاضر در نمونه بايد غيرفعال شوند تا از تخريب پروتئينها جلوگيري شود. درغير اينصورت پروتئازها با شکستن پروتئينها سبب پديدار شدن نقاط مصنوعي در نمايه دو بعدي مي شوند. روشهاي مختلفي براي مقابله با پروتئوليز ضمن آماده‌سازي نمونه وجود دارد, براي مثال استخراج پروتئين در pH بازي، جوشاندن نمونه در SDS ، و همچنين استفاده از مهاركننده‌هاي پروتئازها (PI) به تنهايي يا در تركيب با يکديگر.
مهارکننده هاي پروتئاز را مي توان به محلول ليز کننده افزود اما هميشه اين کار توصيه نمي شود, چراكه اين مواد ممكن است باعث ايجاد تغيير بار الکتريکی در پروتئينهای ديگر شده و سبب ايجاد نقاط مصنوعي شوند. راه حل هاي ديگر جوشاندن نمونه در بافري با pH بالا نظير بافر تريس است که داراي "SDS" باشد. براي غيرفعال كردن پروتئازها با pH پايين از رسوب دادن با "TCA" 20% بر روي يخ مي توان بهره جست.
اين نكته را بايد درنظر داشت كه غيرفعال سازي كامل تمام پروتئازها کاري بسيار سخت است. رسوب دهي توسط "TCA" و استن در كاهش تخريب پروتئينها و خارج ساختن تركيبات تداخل كننده معمولاً مفيد است. اما بايد كاملاً مراقب بود كه پروتئينها در اثر رسوب دادن ناقص و يا بعد از رسوب دادن, در حين محلول کردن دوباره، از دست نروند. نشان داده شده است که محلول‌هاي حاوي تيواوره 2 مولار و اوره 7 مولار كارآيي قابل توجهي در مهار پروتئينازهاي نمونه دارند. تيواوره علاوه بر مفيد بودن درحل كردن پروتئينها به عنوان يك مهاركننده قوي پروتئينازها نيز عمل مي کند.
3-3-3-2- اسيد هاي نوکلئيک
حضور اسيدهاي نوكلئيك نيز مي تواند درحين "IEF" مسئله ساز شود. اين امر ناشي از افزايش در ويسكوزيته ي نمونه و دربعضي از موارد ايجاد كمپلكسهايي با پروتئينهاي نمونه است كه منجر به مهاجرت غيرعادي و ايجاد رگه ها ي افقي و عمودي در نمايه ي ژل الکتروفورز دو بعدي مي شود. اگر مشكلاتي از اين قبيل بوجود آيد بهترين كار متلاشي كردن اسيدنوكلئيك با يك اندونوكلئاز خالص و مناسب و عاري از پروتئاز است. روش ديگر استفاده از توانايي آمفولايت ها در ايجاد كمپلكس با اسيدهاي نوكلئيك و بعد خارج كردن اين كمپلكس ها با اولترا سانتريفوژ است .
3-3-3-3- نمک ها
نمک ها با تغيير در رسانايي و قدرت عبور جريان الکتريکي در ژلهاي "IPG" باعٍث اختلال در "IEF" شده و تا زماني که يونهاي نمکها از انتهاي نوار هاي "IPG" خارج نشوند فوکوسينگ پروتئين ها محقق نخواهد شد, همين امر زمان فوکوسينگ را افزايش مي دهد. حضور نمک در نمونه, ممکن است باعث جابه جايي آب موجود در نوار"IPG" نيز شود, به طوريکه يک سمت ژل خشک و سمت ديگر متورم خواهد شد. از طرف ديگر وجود مقادير زياد نمک در نمونه باعث مي شود پروتئين ها در نواحي نسبتا" عريضي در دو انتهاي ژل فوکوس نشوند. به همين دلايل نمک اضافي موجود در نمونه ها يا بايد خارج شوند يا به کمترين حد ممکن تقليل داده شوند. همانطور که قبلا" اشاره شده است بايد غلظت نمک موجود درنمونه کمتر از 40 ميلي مولار باشد. زمانيکه نمونه در خيساندن ژل بار گيري مي شود بايد غلظت نمک کمتر از 10 ميلي مولار باشد.
براي نمک زدايي از روشهاي مختلفي مي توان استفاده کرد که رايجترين آنها استفاده از دياليز, تغليظ کننده هاي غشايي, ژل فيلتراسيون و رسوب دهي است. دياليز روشي بسيار کارآمد است که در آن کمترين مقدار از نمونه از دست داده ميشود. اما داراي روندي طولاني مدت است و احتيآج به حجم بالايي از محلول دارد. تغليظ کننده هاي غشايي يا دياليز همراه با سانتريفوژ سريعتر صورت ميگيرد, اما امکان اتصال پروتئين ها به غشا دياليز در اين روش بيشتر است. در ژل فيلتراسيون نيز امکان از دست رفتن پروتئين هاي نمونه زياد است.
3-3-3-4- روشهاي رسوبدهي
در روش هاي آماده سازي نمونه, رسوب دادن پروتئين ها به عنوان يک مرحله ي اختياري تلقي مي گردد. اين روش براي جدا کردن انتخابي پروتئين ها از مواد آلاينده و تداخل کننده در محلول مانند نمک ها, دترجنت ها, اسيد هاي نوکلئيک, و غيره به کار گرفته مي شود. از اين روش براي تغليظ پروتئين هاي موجود در يک نمونه که در حالت عادي بسيار رقيق باشند, نيز استفاده مي شود.
بايد توجه داشت که هيچ روش رسوب دهي به طور کامل کارآمد نيست و برخي از پروتئين ها بعد از رسوب داده شدن مجددا" محلول نمي شوند. به همين دليل بسته به هدف از انجام الکتروفورز دو بعدي استفاده کردن از اين روش را در دستور کار مي توان قرار داد. در صورتيکه هدف از انجام الکتروفورز دو بعدی به دست آوردن کاملترين نمايه دو بعدي يک نمونه باشد, بايد از انجام رسوب دهي صرف نظر کرد.