Borna66
04-10-2009, 04:47 PM
در روش الكتروفورز دوبعدي كلاسيك "O’Farrell", "IEF" با استفاده از شيب هاي pH حاصل از به کار گيري حامل آمفولايت (carrier ampholyte) انجام مي پذيرد. حامل هاي آمفولايت مولکولهاي کوچک, محلول و آمفوتر با ظرفيت بافر کنندگي بسيار بالا در نزديک نقطه ايزوالکتريک خود هستند. هم اکنون حامل هاي آمفولايت موجود در بازار مخلوطي متشکل از صدها گونه ي منفرد از پلي مرهايي هستند که pI آنها تمام محدوده ي pH انتخابي را تحت پوشش قرار مي دهد. وقتي اين حامل هاي آمفولايتي در يک ميدان الکتريکي قرار مي گيرند, حامل هاي آمفولايتي که داراي بالاترين pI هستندو بيشترين بار منفي را دارندبه سمت آند حرکت مي کنند. در حاليکه حامل هاي آمفولايتي با پايين ترين pI که داراي بيشترين بار مثبت هستند به سمت کاتد حرکت مي کنند. مابقي حامل هاي آمفولايتي بر اساس pI خود مابين اين دو حد مستقر شده و محيط اطراف خود را با pH مربوطه بافر ميکنند. نتيجه اين وضعيت ايجاد يک شيب pH متوالي خواهد بود.
معمولاً در صورت استفاده از حامل هاي آمفولايتي دست يابي به تكرارپذيري حتي در يك آزمايشگاه مشكل است و در بين آزمايشگاه هاي مختلف دشوارتر. عوامل متعددي در اين امر دخالت دارند, از جمله اينکه حامل هاي آمفولايت توسط فرآيند سنتز پيچيده اي ايجاد مي شوند که کنترل تکرارپذيري آن بسيار دشوار است. اين امر منجر به تفاوت قابل ملاحظه اي در بچ هاي توليدي مختلف شده و ايجاد محدوديت در تکرارپذيري جداسازي پروتئين توسط الکتروفورز دوبعدي را مي نمايد. عامل مهم ديگر اين نکته است که حامل هاي آمفولايت مولکولهاي کوچکي هستند که در ژلهاي "IEF" تثبيت نمي شوند، در نتيجه جريان الکترواندوسموتيک آب که در حين "IEF" به وقوع مي پيوندد منجر به مهاجرت مولکولهاي حامل هاي آمفولايت به سمت کاتد مي گردد. اين روند که به انحراف به کاتد (Cathodic drift) موسوم است، باعث ناپايداري شيب pH شده و با استفاده از ژلهای "IEF" لوله اي تشديد مي شود، چراکه در لوله هاي شيشه اي گروه هايي با بارالکتريکي منفي وجود دارند. درعمل شيب هاي pH با استفاده از روش "O’Farrell" به ندرت از محدوده ي pH 7 فراتر مي روند. اين امر سبب از دست دادن پروتئينهاي بازي مي شود. "O’Farrell" با ايجاد روشي جايگزين موفق به حل اين مشکل شد. اين روش به" Non Equilibrium pH Gradient Electrophoresis, NEPHGE" موسوم است که براي جداسازي پروتئينهاي بازي به کار گرفته مي شود. در اين روش جداسازي براساس تحرک پروتئين درحضور يک شيب pH که سريعا" درحال شکل گيري است، انجام مي پذيرد. اما به هر حال دستيابي به تکرارپذيري در اين روش نيز بسيار دشوار است. مشکل ديگر پايداري مکانيکي کم ژلهاي لوله اي پلي آکريل آميد است که در اين روش ريخته مي شوند. اين ژلهاي لوله اي در حين کار ممکن است کش آمده و بلند تر شوند يا حتي بشکنند, از اين رو کار کردن با آنها نياز به مهارت هاي ويژه اي دارد.
ابداع "IPG" مشکل تکرارپذيري را رفع کرده است. روش "IPG-IEF" روش منتخب فعلي براي بعد اول در الکتروفورز دو بعدي به منظور بررسي هاي پروتئوميکس است. "IPG" ها براساس استفاده ازمعرفهاي ايموبلاين (Immobiline) تهيه مي شوند. ايموبلاين ها مشتقات ده گانه اي از آكريل آميد هستند كه ساختار پايه ي يكساني دارند (شکل 4-3). ايموبلاين ها سري بافرهايي را ايجاد مي كنند كه داراي pH متفاوت بين 12-1 هستند. بافرهاي ايموبلاين دسته مولکولهاي کاملا" شناخته شده اي هستند که هر يک داراي يک گروه بافر کننده ي اسيدي يا بازي متصل به يک مونومر آکريل آميد هستند. از آنجايي كه انتهاي واكنش دهنده مولكول با ماتريكس آكريل آميد پليمره مي شود, ايموبلاين هاي بافركننده درحين پليمريزاسيون ايجاد شيب pH مي كنند كه بطور كووالانت از طريق باندهاي وينيل به شبکه ي پلي آكريل اميد متصل مي شوند. "IPG" ايجاد شده از اين طريق نسبت به اثرات الكترواندوسموسيز مقاوم است, به همين دليل ايموبلاين ها ايجاد شيب هاي pH بسيار پايداري را مي كنند كه تكرارپذيري را افزايش مي دهد. از طرف ديگر نوار هاي "IPG" بر روي پايه ي پلاستيکي قرار دارند که کار کردن با آنها را بسيار ساده مي کند. نوار هاي"IPG" ظرفيت بارگيري بيشتري درمقايسه با ژلهاي لوله اي دارند. "IEF" بر روي نوارهاي "IPG" با قطر 3 يا 5 ميليمتر انجام مي شود. نمونه ها را مي توان توسط جامهاي كوچك يا خيساندن در روي ژل به ژل افزود. بعد از "IEF" نوارهاي "IPG" توسط بافر "SDS" متعادل سازي مي شوند و بعد از آن بصورت افقي يا عمودي بر روي ژلهاي "SDS" در بعد دوم قرار داده مي شوند.
روشهايي براي آماده سازي دستي اين ژلها وجود دارد كه البته اكنون از اين روشها به ندرت استفاده مي شود و بيشتر نوارهاي "IPG" آماده مصرف مي شوند. اما در روشهاي دستي ژلهاي تخت "IPG" با محدودة pH مورد نظر بر روي ورقه هايي شفاف (Gel Bound tagged films) ريخته مي شوند كه ژل پلي آکريل آميد به خوبي به آنها متصل مي شود. ژلها بعد از پليمريزه شدن کاملا" با آب ديونيزه شسته مي شوند؛ يعني شش بار و هر بار به مدت 10 دقيقه در آب ديونيزه و بعد در گليسرول 2% به مدت 30 دقيقه غوطه ور مي شوند و سپس در دماي اتاق در نقطه اي كه عاري از هرگونه گرد و غباري باشد, قرار داده مي شوند تا خشك گردند و روي آنها با ورقه اي پلاستيكي پوشيده مي شود. در صورت عدم تمايل به استفاده سريع از اين ژلها مي توان آنها را به مدت يك سال در 20- درجه نگهداري كرد. قبل از استفاده، ژلها به نوارهاي 5-3 ميلي متري بريده مي شوند. همانطور كه ذكر شد نوارهاي "IPG" از پيش آماده در بازار موجود هستند. اين نوارها در طولهاي متفاوت بوده، و هر چه ميدان طول نوارها بلندتر باشد, تعداد پروتئينهايي كه مي توانند از هم تفكيك گردند بيشتر خواهد بود. نوارهاي 18 يا 24 سانتيمتري معمولاً براي جداسازي با قدرت تفكيك بالا استفاده مي شوند درحاليكه نوارهاي كوتاهتر 7 يا 11 سانتيمتري براي غربالگري سريع نمونه ها مورد استفاده قرار مي گيرند.
معمولاً در صورت استفاده از حامل هاي آمفولايتي دست يابي به تكرارپذيري حتي در يك آزمايشگاه مشكل است و در بين آزمايشگاه هاي مختلف دشوارتر. عوامل متعددي در اين امر دخالت دارند, از جمله اينکه حامل هاي آمفولايت توسط فرآيند سنتز پيچيده اي ايجاد مي شوند که کنترل تکرارپذيري آن بسيار دشوار است. اين امر منجر به تفاوت قابل ملاحظه اي در بچ هاي توليدي مختلف شده و ايجاد محدوديت در تکرارپذيري جداسازي پروتئين توسط الکتروفورز دوبعدي را مي نمايد. عامل مهم ديگر اين نکته است که حامل هاي آمفولايت مولکولهاي کوچکي هستند که در ژلهاي "IEF" تثبيت نمي شوند، در نتيجه جريان الکترواندوسموتيک آب که در حين "IEF" به وقوع مي پيوندد منجر به مهاجرت مولکولهاي حامل هاي آمفولايت به سمت کاتد مي گردد. اين روند که به انحراف به کاتد (Cathodic drift) موسوم است، باعث ناپايداري شيب pH شده و با استفاده از ژلهای "IEF" لوله اي تشديد مي شود، چراکه در لوله هاي شيشه اي گروه هايي با بارالکتريکي منفي وجود دارند. درعمل شيب هاي pH با استفاده از روش "O’Farrell" به ندرت از محدوده ي pH 7 فراتر مي روند. اين امر سبب از دست دادن پروتئينهاي بازي مي شود. "O’Farrell" با ايجاد روشي جايگزين موفق به حل اين مشکل شد. اين روش به" Non Equilibrium pH Gradient Electrophoresis, NEPHGE" موسوم است که براي جداسازي پروتئينهاي بازي به کار گرفته مي شود. در اين روش جداسازي براساس تحرک پروتئين درحضور يک شيب pH که سريعا" درحال شکل گيري است، انجام مي پذيرد. اما به هر حال دستيابي به تکرارپذيري در اين روش نيز بسيار دشوار است. مشکل ديگر پايداري مکانيکي کم ژلهاي لوله اي پلي آکريل آميد است که در اين روش ريخته مي شوند. اين ژلهاي لوله اي در حين کار ممکن است کش آمده و بلند تر شوند يا حتي بشکنند, از اين رو کار کردن با آنها نياز به مهارت هاي ويژه اي دارد.
ابداع "IPG" مشکل تکرارپذيري را رفع کرده است. روش "IPG-IEF" روش منتخب فعلي براي بعد اول در الکتروفورز دو بعدي به منظور بررسي هاي پروتئوميکس است. "IPG" ها براساس استفاده ازمعرفهاي ايموبلاين (Immobiline) تهيه مي شوند. ايموبلاين ها مشتقات ده گانه اي از آكريل آميد هستند كه ساختار پايه ي يكساني دارند (شکل 4-3). ايموبلاين ها سري بافرهايي را ايجاد مي كنند كه داراي pH متفاوت بين 12-1 هستند. بافرهاي ايموبلاين دسته مولکولهاي کاملا" شناخته شده اي هستند که هر يک داراي يک گروه بافر کننده ي اسيدي يا بازي متصل به يک مونومر آکريل آميد هستند. از آنجايي كه انتهاي واكنش دهنده مولكول با ماتريكس آكريل آميد پليمره مي شود, ايموبلاين هاي بافركننده درحين پليمريزاسيون ايجاد شيب pH مي كنند كه بطور كووالانت از طريق باندهاي وينيل به شبکه ي پلي آكريل اميد متصل مي شوند. "IPG" ايجاد شده از اين طريق نسبت به اثرات الكترواندوسموسيز مقاوم است, به همين دليل ايموبلاين ها ايجاد شيب هاي pH بسيار پايداري را مي كنند كه تكرارپذيري را افزايش مي دهد. از طرف ديگر نوار هاي "IPG" بر روي پايه ي پلاستيکي قرار دارند که کار کردن با آنها را بسيار ساده مي کند. نوار هاي"IPG" ظرفيت بارگيري بيشتري درمقايسه با ژلهاي لوله اي دارند. "IEF" بر روي نوارهاي "IPG" با قطر 3 يا 5 ميليمتر انجام مي شود. نمونه ها را مي توان توسط جامهاي كوچك يا خيساندن در روي ژل به ژل افزود. بعد از "IEF" نوارهاي "IPG" توسط بافر "SDS" متعادل سازي مي شوند و بعد از آن بصورت افقي يا عمودي بر روي ژلهاي "SDS" در بعد دوم قرار داده مي شوند.
روشهايي براي آماده سازي دستي اين ژلها وجود دارد كه البته اكنون از اين روشها به ندرت استفاده مي شود و بيشتر نوارهاي "IPG" آماده مصرف مي شوند. اما در روشهاي دستي ژلهاي تخت "IPG" با محدودة pH مورد نظر بر روي ورقه هايي شفاف (Gel Bound tagged films) ريخته مي شوند كه ژل پلي آکريل آميد به خوبي به آنها متصل مي شود. ژلها بعد از پليمريزه شدن کاملا" با آب ديونيزه شسته مي شوند؛ يعني شش بار و هر بار به مدت 10 دقيقه در آب ديونيزه و بعد در گليسرول 2% به مدت 30 دقيقه غوطه ور مي شوند و سپس در دماي اتاق در نقطه اي كه عاري از هرگونه گرد و غباري باشد, قرار داده مي شوند تا خشك گردند و روي آنها با ورقه اي پلاستيكي پوشيده مي شود. در صورت عدم تمايل به استفاده سريع از اين ژلها مي توان آنها را به مدت يك سال در 20- درجه نگهداري كرد. قبل از استفاده، ژلها به نوارهاي 5-3 ميلي متري بريده مي شوند. همانطور كه ذكر شد نوارهاي "IPG" از پيش آماده در بازار موجود هستند. اين نوارها در طولهاي متفاوت بوده، و هر چه ميدان طول نوارها بلندتر باشد, تعداد پروتئينهايي كه مي توانند از هم تفكيك گردند بيشتر خواهد بود. نوارهاي 18 يا 24 سانتيمتري معمولاً براي جداسازي با قدرت تفكيك بالا استفاده مي شوند درحاليكه نوارهاي كوتاهتر 7 يا 11 سانتيمتري براي غربالگري سريع نمونه ها مورد استفاده قرار مي گيرند.