شيمي زيستي

[Borna66]

جداسازي پروتئينها
جداسازي مخلوط هاي پروتئيني پيچيده با قدرت تفكيكي و قابليت تكرارپذير بالا, براي انجام موفقيت آميز پروتئوميكس بسيار پراهميت است. در ساليان اخير ترکيب الکتروفورز دو بعدي, طيف سنجي جرمي, و ابزار بيوانفورماتيک در مقياس بسيار وسيعي براي تحقيقات پروتئوميکس به کار گرفته شده است. با استفاده ي گسترده از الکتروفورز دو بعدي, محدوديت هاي اين روش به تدريج مشخص شده اند. اين محدوديت ها عبارتند از:

با اين روش نمي توان پروتئوم را به طور کامل آناليز کرد. پروتئين هاي ظاهر شده بر روي يک ژل فقط نماينده قسمتي از تمام پروتئين هاي موجود در نمونه هستند. به طور کلي آن پروتئين هايي که در ژل ظاهر مي شوند پروتئين هايي با فراواني بالا در نمونه هستند. پروتئين هايي که در تعداد نسخه هاي کم حضور دارند با روشهاي رنگ آميزي موجود نمايان نمي شوند. علاوه بر اين پروتئين هاي بسيار بزرگ, بسيار کوچک, بازي و پروتئين هاي هيدروفوبيک نيز در شرايط معمول آشکار نمي شوند. يکي از مشکلات اصلي در الکتروفورز دو بعدي پروتئين هاي غشايي با هيدروفوبيسيته بسيار زياد هستند که در روشهاي محلول سازي رايج به صورت محلول در نمي آيند.

دقت تعيين مقدار کمي نقاط به خصوص در رنگ آميزي نقره زياد نيست, چرا که محدوده ي ديناميک اين رنگ آميزي وسيع نبوده و همينطور خصوصيت رنگ پذيري پروتئين ها با يکديگر متفاوت است. کوماسي آبي براي اندازه گيري مقدار پروتئين ها مناسب تر است اما حساسيت آن کم است.

اتوماتيک کردن آين روش بسيار سخت است و به همين دليل روشي با ظرفيت آناليز زياد نيست.

براي رفع اين محدوديت ها, روشهاي ابداعي زيادي براي الکتروفورز دو بعدي ايجاد شده است. براي مثال استفاده از دترجنتهاي قوي تر, جزء به جزء کردن نمونه, استفاده از IPG با محدوده ي pH باريک, رنگ هاي فلورسانت و حتي روباتها براي بريدن و هضم آنزيمي ژل ها. به علاوه پيشرفتهاي زيادي نيز در ابداع و توسعة روشهايي جايگزين براي جداسازي پروتئينها در پروتئوميكس بدست آمده است, اما هنوز هيچکدام نتوانسته اند جايگزين قابل رقابتي براي الكتروفورز دوبعدي باشند. دليل اين امر خصوصيات ويژه ي اين روش است که عبارتند از:

� غناي اطلاعات نهفته در داده هاي بدست آمده از الکتروفورز دو بعدي - اطلاعات مختلفي از نقاط ظاهر شده بر روي ژل الکتروفورزبدست مي آيد. از جمله نقطه ي ايزوالکتريک, وزن مولکولي و کميت نسبی آن. در ترکيب با طيف سنجي جرمي هر نقطه را مي توان تعيين هويت و ويژگي نمود. با توجه به ظهور چندين صد نقطه بر روي يک ژل به حجم زياد اين اطلاعات مي توان پي برد.

امکان جداسازي و تعيين پروتئين هايي با تغيير بعد از ترجمه - در اغلب مواقع, پروتئين هايي که بعد از ترجمه تغيير يافته اند به صورت دسته نقاطي که به صورت يک توده عمودي يا افقي هستند در ژل الکتروفورز دو بعدي ظاهر مي شوند. اين پروتئين هاي تغيير يافته به سهولت با طيف سنجي جرمي قابل تشخيص هستند.

قابليت تفکيک زماني و مکاني مراحل آناليز پروتئوم - مي توان الکتروفورز دو بعدي را در يک آزمايشگاه تحقيقاتي انجام داد و بعد از انتخاب نقاط پروتئيني مورد علاقه, آنها را در زماني ديگر در مرکزي خدماتي, تعيين هويت کرد. به علاوه ژلهاي خشک شده ي الکتروفورز دو بعدي را مي توان سالها نگاهداري کرد و سپس با طيف سنجي جرمي آناليز نمود. بدين ترتيب مي توان بايگاني کم حجم و پر ارزشي را در اختيار داشت.

سهولت و ارزاني نسبي � انجام آن در مقايسه با ديگر روشها از سهولت بسيار بيشتري بر خوردار است و اغلب آزمايشگاه ها با تکنيک هاي رايج الکتروفورز يک بعدي آشنايي دارند. همچنين قيمت تجهيزات و مواد در مقايسه با ديگر روشها بسيار ارزانتر است.

به هر حال پيشرفت هاي اخير به شدت توانايي هاي الکتروفورز دو بعدي را براي آناليزر پروتئوم افزايش داده است و به نظر مي آيد فعلا", و البته تا آينده اي نه چندان دور, الکتروفورز دو بعدي تکنيک اصلي در جداسازي پروتئين ها در پروتئوميکس باقي بماند.

پيوست
پروتئوميكس: علمي كه به بررسي پروتئين هاي سنتز شده موجود زنده به عنوان منبع اطلاعات در مورد موجود زنده و نحوه ي سازوكار بدن آن مي پردازد.

[Borna66]

آناليز تصويري پروتئين هاي به دست آمده بر روي ژل الكترروفورز
روشهاي متفاوت در آشکارسازي ژل هاي الکتروفورز دو بعدي به فنون تصويربرداري خاص خود نياز دارند. اين فنون بايد قادر به تشخيص علائم کروموژنيک مختلف و علائم فلورسانت باشند براي اين منظور از دستگاه هاي مختلفي چون اسکنر اسناد Document scanner, دوربين CCD Charged �coupled device camera, و دانسيتومترهاي ليزري استفاده مي شود.

با توجه به تعداد نقاط بسيار زياد ةاهر شده بر روي ژل الکتروفورز دو بعدي, بهترين روش آناليز با استفاده از کامپيوتر صورت مي پذيرد. با استفاده از ابزار کامپيوتري مي توان حتي نقاط کمرنگ را تشخيص داد و تعيين اندازه کرد, تصاوير ژل هاي متفاوت را با يکديگر مقايسه نمود و تغييرات کمي بيان پروتئين ها را در ژل هاي تهيه شده از يک نمونه در شراطي متفوت را مشخص نمود. چندين نرم افزار مطرح براي چنين کاربردي در بازار موجود است:Z3 ساخت Compugen, Melanie V از Genbio و Amersham و PD Quest از BioRad. تمامي اين نرم افزارها ابتدا تصوير ژل را در برنامه نشان مي دهندو قادر به ويراستن تصاوير در قالب TIFF هستند. سپس اين نرم افزارها به تشخيص نقاط مي پردازند, اطنکار به صورت خودکار صورت گرفته و قابليت ويراستاري دستي را دارند. با تنظيم نحوه ي تشخيص نقاط مي توان اين نحوه را براي يک سري از ژلها اعمال کرد. بعد از اين مرحله نرم افزارها شروع به تطابق نقاط يکسان بر روي يک سري از ژل هاي مورد نظر و انتخاب شده مي نمايند. اولين مرحله در اين کار تعيين يکي از ژل ها به عنوان ژل مرجع است. در ژل مرجع چندين نقطه ي پروتئيني به عنوان نقاط اصلي به منظور پيدا کردن جفت هاي يکسان آنها بر روي ژل هاي ديگر تعيين مي شوند. سپس تطابق نقاط جفت شروع مي شود. با انجام اين مرحله نطابق کل نقاط ژل ها شروع خواهد شد. بعد از اين مرحله ويراستاري و تصحيح دقيق تطابق هاي انجام شده صورت مي گيرد. اين مرحله براي افزايش دقت در مقايسه بين ژل ها ضروري است. يکي از توانايي هاي اين نرم افزارها امکان ايجاد ژلهاي مصنوعي يا ژلهاي ميانگين Average gels با استفاده از ژلهاي تطابق يافته حاصل از يک نمونه در يک وضعيت مشخص است. اين ژلهاي ميانگين براي بررسي تغييرات در بيان پروتئين در بين دسته هاي مختلف ژلها بسيار کار آمد هستند.

برخي مواقع در تصاوير ژلهاي الکتروفورز دو بعدي اختلاف در شدت نقاط ناشي از اختلاف در بيان پروتئين ها نيست, بلکه اختلاف در آماده سازي نمونه, ميزان بارگيري, نحوه ي رنگ آميزي و حتي تصوير برداري موجد اين اختلاف است. درچنين مواردي نرم افزار ها قادر به نرماليزه کردن تصاويز برای جبران اين اختلاف در شدت نقاي هستند. اينکار توسط رجوع به نقاطي مي شود که از عدم تغيير در ميزان آنها در طي آزمايشهاي مختلف اطمينان وجود دارد.

در نهايت آناليز اطلاعات شروع خواهد شد. در ابتدا نقاطي نشان داده مي شوند که براي آنها ويژگي خاصي تعريف شده باشد, مثلا" نقاي تطابق يافته اي که بيش از دو برابر اختلاف در ژلهاژ مقايسه شده دارند. وقتي که گروه خاصي از نقاط انتخاب شدندتغييرات در شاخص هاي نقاط, مثلا" دانسيته نوري يا حجم نقاي, به صورت هيستوگرامهايي نشان داده خواهند شد. گزارش هاي آماري حاوي پارامترهاي آماري نظير ميانگين ها, انحراف معيار و وارياسيون ايجاد مي شود. و آمارهاي ساده اي چون آزمونStudent�s t-test نيز در اين نرم افزار ها اجرا مي شوند.

[Borna66]

مباني الکتروفورز
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.
در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل 5-1).
شکل 5-1- شمايي از سيستم الکتروفورز
جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.
5-1-1-1- اثر عوامل الکتريکي
در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 5-1)
V=IR
معادله 5-1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است
معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند.
P=V2/R يا P=I2R يا P=VI
معادله 5-2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.
اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد (جدول 5-1). براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.
جدول 5-1- تاٍثير ثابت نگاه داشتن پارامترهاي الکتريکي در سيستم هاي بافري مختلف
انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود.
5-1-1-1- اثر سيستم هاي بافري و pH
پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.
5-1-1-2- اثر حرارت
براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم � شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.
5-2- الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.
اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.
درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.
اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.
مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.
رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
5-2-1- نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل 5-2).
شکل 5-2- نحوه ي پلي مريزاسيون آکريل آميد
پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.
راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.
اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.
بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است

نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.

[Borna66]

انجام بسيار سريع کريستالوگرافي اشعة ايکس

16جولاي 2003- براي اولين بار با همکاري چند شرکت و سازمان بين‌المللي کريستالوگرافي اشعة X از يک پروتئين در مدت زمان چند پيکوثانيه امکان‌پذير شد.
در اين فناوري امکان تصويربرداري از يک مولکول زيستي بسيار مهم در حالي که با سرعت بسيار زياد فعاليت مي‌کند فراهم شده است. اگر چه که امکان عکس‌برداري سريع از هزاران پروتئين فراهم شده ولي امکان ثبت تمامي حرکات حتي در مورد يک پروتئين مشخص وجود ندارد. فيلم‌هاي قبلي که با اشعة X از پروتئين‌ها در واحد زماني نانوثانيه بدست آمده بود بسيارکندتر از آن است که بتوانند مراحل مختلف بسياري از فعاليت‌هاي پروتئيني را ثبت کنند.
اخيراً محققين مرکز سينکروترون و تشعشع اروپا در فرانسه(esrf) فيلم‌هايي در واحد زماني پيکوثانيه از يک مولکول ميوگلوبين جهش‌يافته[1] در حال آزاد شدن از مولکول سمي مونوکسيدکربن (co) متصل به آن تهيه کرده‌اند.
ميوگلوبين پروتئيني است که اکسيژن را در بافت‌هاي عضلاني ذخيره مي‌کند. محققين به اين دليل از يک مولکول جهش‌يافته ميوگلوبين استفاده کردند که ساختار اتمي بسيار پيچ‌خوردة آن باعث مي‌شود که مولکول‌هاي Co نسبت به حالت طبيعي بسيار سريع‌تر از آن جدا شوند.
براي ثبت اين وقايع، آن‌ها ابتدا يک پالس‌ليزر در يک پيکوثانيه به پروتئين تاباندند تا مولکول Co جدا شود. بعد از اين عمل به سرعت پالس‌هاي شديد 150 پيکوثانيه‌اي اشعة X را بر روي پروتئين تاباندند. نکتة مهم اين روند توانايي تفکيک پالسهاي اشعة X در دستگاه سينکروترون بود. يک دوربين فيلم‌برداري Ccd الگوهايي که در اثر عبور موفقيت‌آميز اشعة X از پروتئين بدست مي‌آمد را ثبت مي‌کرد.
نتيجه اين آزمايش نشان داد که مولکول Co در قسمت‌هاي مختلف مولکول پروتئين حرکت مي‌کند و در عين حال ميوگلوبين نيز براي رسيدن به وضعيتي براي بيرون انداختن مولکول Co به‌طور مرتب در حال تغيير شکل است.
علاوه بر اينکه اين تکنيک محققان را در بررسي بسياري از روندهاي حرکتي در مولکولهاي پروتئيني ياري مي‌دهد، ثبت فيلم‌ها در زمان پيکوثانيه بطور اطمينان بخشي با واحد زماني شبيه‌سازهاي ديناميک مولکولي مطابقت مي‌کند و لذا امکان مقايسة بيشتر بين تئوري و آزمايش فراهم مي‌شود.

[Borna66]

Sds-page پروتئين ها
سديم دودسيل سولفات"SDS" يک دترجنت آنيوني است که به اغلب مولکولهاي پروتئيني در محلول هاي مايي و درpH هاي متفاوت متصل مي شود. "SDS" تقريبا" به همه ي پروتئينها با نسبت تقريبي 4/1 گرم در 1 گرم پروتين اتصال مي يابد. براي همين "SDS" باعث القاء بار الکتريکي منفي متناسب با اندازه در پلي پپتيدها ميگردد. علاوه بر اين "SDS" با تخريب پيوندهاي هيدروژني و بر هم کنش هاي هيدروفوبي, باعث تخريب ساختمان دوم و سوم پروتئين ها مي گردد. در صورت حضور يک ماده ي احيا کننده نظير "DTT" پيوندهاي دي سولفيدي از گسسته وتاخوردگي پروتئين ها به طور کامل از بين مي رود. پلي پپتيدهايي که شکل طبيعي اشان توسط "SDS" بر هم خورده و احيا هم شده اند به شکل ميله هايي انعطاف پذير در مي آيند که داراي بار منفي يک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است, جداسازي پروتئين ها در الکتروفورز تحت چنين شرايطي تقريبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولي آنها است.

برخي پروتئين ها در "SDS-PAGE" رفتاري غيرعادي دارند به خصوص برخي گليكوپروتئين ها به مقادير عادي از "SDS" متصل نمي شوند, در نتيجه نسبت بار الکتريکي به وزن مولکولي در آنها مشابه اين نسبت در پروتئين هاي ديگر نيست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتيجه وزن مولکولي بيشتري از خود نشان خواهند داد.

پروتئين هايي با بارمنفي زياد و يا با بار مثبت زياد, مثلا" هيستون ها, يا پروتئين هاي غني از پرولين, مثلا" كلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غيرطبيعي وزن مولکولي بالايي از خود نشان مي دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازي پروتئين هايي با جرم مولكولي خيلي مشابه كه داراي تغييرات بعد از ترجمه, نظير استيليشن يا متيليشن يا فسفروريليشن, هستند از ارزش کمي برخوردار است. براي آناليز چنين پروتئين هاي تغيير يافته اي ، از روش PAGE با اوريک اسيد استفاده مي شود كه در آن هم وزن مولكولي و هم بار پروتئين در فرآيند جداسازي دخيل است . پروتئين در pH اسيدي بار مثبت دارد و در ميدان الكتريكي به سمت كاتد حركت مي كند . به اين دليل از روش PAGE اسيداوره عموماً براي جداسازي پروتئين هايي با سايز يكسان و بار متفاوت استفاده مي شود.

[Borna66]

ايزو الكتروفوكوسينگ
ايزوالکتروفوکوسينگ "IEF" روش الکتروفورزي است که درآن پروتئين ها بر اساس نقطه ي ايزو الکتريک pI خود و با استفاده از ژل پلي آکريل آميدي که داراي شيب pH و حاوي غلظت زياد اوره است, از يکديگر جدا مي شوند. بنابر اين در اين نوع از الکتروفورز, پروتئين ها بر اساس بار الکتريکي, که يک خصوصيت ذاتي و وابسته به ساختار اسيد آمينه هايشان است, از يکديگر جدا مي شوند.

در اين فصل به اصول جداسازي توسط "IEF", روشهاي مورد استفاده و نکات مهمي که در حين انجام اين فن بايد در نظر گرفته شوند, مي پردازيم.
4-1- مباني نظري ايزوالکتروفوکوسينگ



بار الکتريکي خالص (Net charge) پروتئين ها يک ويژگي ذاتي و ناشي از ساختار اسيد هاي آمينه آنها است. پروتئين ها مولکولهايي آمفوتر هستند, يعني بسته به pH محيطي که در آن قرار می گيرند داراي بار الکتريکي خالص مثبت, منفي ويا خنثي مي شوند. نوع, تعداد و توالي اسيدهاي آمينه ي سازنده ي پروتئين, بار الكتريكي خالص آن را تعيين مي کند. در واقع بار الکتريکي خالص يک پروتئين, جمع جبري تمام بار هاي مثبت ومنفي زنجيره هاي جانبي اسيدهاي آمينه ي تشکيل دهنده ی آن و دو انتهاي آميني و کروبکسيلي اش است. به خصوص اسيدهاي آمينه ای كه داراي زنجيره هاي جانبي قابل يونيزه شدن هستند, نقش موثرتري در اين مسئله دارند. با توجه به اين نکته که واكنشهاي يونشي گروه هاي جانبي اسيدهاي آمينه برگشت پذيرند, تاثير pH محيط در بار اکتريکي آنها کاملا" قابل انتظار است. براي مثال اسيد آمينه بازي مثل هيستدين كه داراي گروه ايميدازول است, بسته به pH محيطي که در آن قرار مي گيرد داراي بار الکتريکي خالص متفاوتي خواهد شد. pI هيستيدين برابر با 8/7 است, مولکول در pI خود داراي بارالکتريکي خالص صفر است. هيستيدين در pH بالاتر از pI خود داراي بار الکتريکي خالص منفي و در pH پايين تر داراي بار الکتريکي خالص مثبت خواهد شد(شکل 3-5).

همين وضعيت در مورد ديگر اسيدهاي آمينه بازي مثل لايزين كه داراي گروه آمين در موقعيت اپسيلون زنجيره جانبی خود است و آرژی نين كه دو گروه آميني دارد, رخ مي دهد؛ بدين ترتيب که گروه آميني در pH پايين تر از pKa خود داراي بار مثبت و در pH بالاتر از pKa بدون بار الکتريکي هستند؛ بدين ترتيب اسيد آمينه در مقادير pH كمتر از pI داراي بار مثبت و در مقادير pH بالاتر از pI منفي است. برعكس،گروه هاي كربوکسيل زنجيره ي جانبي اسيدهاي آمينه ی اسيدي مثل اسيد آسپارتيك و اسيد گلوتاميك که در pH هايي بالاتر از ميزان pKa خود داراي بار منفي و درمقادير pH كمتر از مقادير pKa بدون بار الکتريکي خواهند بود؛ در نتيجه کل مولکول مانند اسيد هاي آمينه بازي در مقادير pH كمتر از pI داراي

بار مثبت و در مقادير pH بالاتر از pI منفي خواهند بود (شکل 3-6).


نسبت گروه هاي جانبي اسيدهاي آمينه موجود در يک پروتئين كه داراي بار الكتريكي يا بدون بار الكتريكي هستند, بستگي به pH محلول خارجي دارد كه در آن قرار دارند. براي مثال در يك pH بالا مثل 12 گروه هاي كربوكسيل داراي بار الكتريكي منفي هستند و زنجيره هاي جانبي اسيدهاي آمينه بازي بدون بارالكتريكي هستند در حاليكه درpH هاي پايين و كمتر از 4، گروه هاي كربوكسيل اسيدهاي آمينه اسيدي بدون بار الكتريكي و اسيدهاي آمينه بازي داراي بار الكتريكي مثبت هستند. بنابراين اگر پروتئين داراي ميزان بيشتري از اسيدهای آمينه گلوتاميك اسيد و آسپارتيك اسيد باشد معمولاً درگروه پروتئينهاي اسيدي دسته بندي مي شود زيرا در pH خنثی داراي بار الكتريكي خالصِ منفي است. بالعكس اگر پروتئيني داراي اسيدهاي آمينه بازي بيشتري باشد يعني داراي لايزين و آرژی نين بيشتر باشد, در pH خنثی بار مثبت خالص خواهد داشت.

بدين ترتيب پروتئين ها در pH بالاتر از pI خود داراي بار منفي و در pH پايين تر از pI خود داراي بار مثبت خواهند بود. بطور عملي pI يك پروتئين (نقطة ايزوالكتريك پروتئين) جايي در يك ميدان الكتريكي است که پروتئين نه به سمت كاتد (الکترود منفي) مهاجرت مي كند و نه به سمت آند (الكترود مثبت).

در حضور يک گرادیان pH و تحت تاثير يک ميدان الکتريکي پروتئين به سمت نقطه اي در شيب حرکت مي کند که بارالکتريکي خالصش صفر شود. پروتئيني با بار الکتريکي خالص منفي به سمت آند مهاجرت خواهد کرد, تا جايي که بار الکتريکي منفي اش کمتر شود تا به بار الکتريکي صفر برسد. در صورتيکه اين پروتئين از محدوده ي pI خود خارج شود, فورا" بار دار مي شود و به pI خود باز مي گردد. در واقع اين پديده ي فوکوسينگ يا متمرکز شدن در يک نقطه است که در "IEF" صورت مي پذيرد و باعث تجمع و تمرکز يک پروتئين در نقطه ايزو الکتريک خود شده و ابزاري قدرتمند در جداسازي پروتئين ها براساس اختلاف هرچند ناچيز در بار الکتريکي شان در اختيار قرار مي دهد.

[Borna66]

ايزوالکتروفوکوسينگ با شيب هاي pH تثبيت شده (IPG)
در روش الكتروفورز دوبعدي كلاسيك "O’Farrell", "IEF" با استفاده از شيب هاي pH حاصل از به کار گيري حامل آمفولايت (carrier ampholyte) انجام مي پذيرد. حامل هاي آمفولايت مولکولهاي کوچک, محلول و آمفوتر با ظرفيت بافر کنندگي بسيار بالا در نزديک نقطه ايزوالکتريک خود هستند. هم اکنون حامل هاي آمفولايت موجود در بازار مخلوطي متشکل از صدها گونه ي منفرد از پلي مرهايي هستند که pI آنها تمام محدوده ي pH انتخابي را تحت پوشش قرار مي دهد. وقتي اين حامل هاي آمفولايتي در يک ميدان الکتريکي قرار مي گيرند, حامل هاي آمفولايتي که داراي بالاترين pI هستندو بيشترين بار منفي را دارندبه سمت آند حرکت مي کنند. در حاليکه حامل هاي آمفولايتي با پايين ترين pI که داراي بيشترين بار مثبت هستند به سمت کاتد حرکت مي کنند. مابقي حامل هاي آمفولايتي بر اساس pI خود مابين اين دو حد مستقر شده و محيط اطراف خود را با pH مربوطه بافر ميکنند. نتيجه اين وضعيت ايجاد يک شيب pH متوالي خواهد بود.

معمولاً در صورت استفاده از حامل هاي آمفولايتي دست يابي به تكرارپذيري حتي در يك آزمايشگاه مشكل است و در بين آزمايشگاه هاي مختلف دشوارتر. عوامل متعددي در اين امر دخالت دارند, از جمله اينکه حامل هاي آمفولايت توسط فرآيند سنتز پيچيده اي ايجاد مي شوند که کنترل تکرارپذيري آن بسيار دشوار است. اين امر منجر به تفاوت قابل ملاحظه اي در بچ هاي توليدي مختلف شده و ايجاد محدوديت در تکرارپذيري جداسازي پروتئين توسط الکتروفورز دوبعدي را مي نمايد. عامل مهم ديگر اين نکته است که حامل هاي آمفولايت مولکولهاي کوچکي هستند که در ژلهاي "IEF" تثبيت نمي شوند، در نتيجه جريان الکترواندوسموتيک آب که در حين "IEF" به وقوع مي پيوندد منجر به مهاجرت مولکولهاي حامل هاي آمفولايت به سمت کاتد مي گردد. اين روند که به انحراف به کاتد (Cathodic drift) موسوم است، باعث ناپايداري شيب pH شده و با استفاده از ژلهای "IEF" لوله اي تشديد مي شود، چراکه در لوله هاي شيشه اي گروه هايي با بارالکتريکي منفي وجود دارند. درعمل شيب هاي pH با استفاده از روش "O’Farrell" به ندرت از محدوده ي pH 7 فراتر مي روند. اين امر سبب از دست دادن پروتئينهاي بازي مي شود. "O’Farrell" با ايجاد روشي جايگزين موفق به حل اين مشکل شد. اين روش به" Non Equilibrium pH Gradient Electrophoresis, NEPHGE" موسوم است که براي جداسازي پروتئينهاي بازي به کار گرفته مي شود. در اين روش جداسازي براساس تحرک پروتئين درحضور يک شيب pH که سريعا" درحال شکل گيري است، انجام مي پذيرد. اما به هر حال دستيابي به تکرارپذيري در اين روش نيز بسيار دشوار است. مشکل ديگر پايداري مکانيکي کم ژلهاي لوله اي پلي آکريل آميد است که در اين روش ريخته مي شوند. اين ژلهاي لوله اي در حين کار ممکن است کش آمده و بلند تر شوند يا حتي بشکنند, از اين رو کار کردن با آنها نياز به مهارت هاي ويژه اي دارد.
ابداع "IPG" مشکل تکرارپذيري را رفع کرده است. روش "IPG-IEF" روش منتخب فعلي براي بعد اول در الکتروفورز دو بعدي به منظور بررسي هاي پروتئوميکس است. "IPG" ها براساس استفاده ازمعرفهاي ايموبلاين (Immobiline) تهيه مي شوند. ايموبلاين ها مشتقات ده گانه اي از آكريل آميد هستند كه ساختار پايه ي يكساني دارند (شکل 4-3). ايموبلاين ها سري بافرهايي را ايجاد مي كنند كه داراي pH متفاوت بين 12-1 هستند. بافرهاي ايموبلاين دسته مولکولهاي کاملا" شناخته شده اي هستند که هر يک داراي يک گروه بافر کننده ي اسيدي يا بازي متصل به يک مونومر آکريل آميد هستند. از آنجايي كه انتهاي واكنش دهنده مولكول با ماتريكس آكريل آميد پليمره مي شود, ايموبلاين هاي بافركننده درحين پليمريزاسيون ايجاد شيب pH مي كنند كه بطور كووالانت از طريق باندهاي وينيل به شبکه ي پلي آكريل اميد متصل مي شوند. "IPG" ايجاد شده از اين طريق نسبت به اثرات الكترواندوسموسيز مقاوم است, به همين دليل ايموبلاين ها ايجاد شيب هاي pH بسيار پايداري را مي كنند كه تكرارپذيري را افزايش مي دهد. از طرف ديگر نوار هاي "IPG" بر روي پايه ي پلاستيکي قرار دارند که کار کردن با آنها را بسيار ساده مي کند. نوار هاي"IPG" ظرفيت بارگيري بيشتري درمقايسه با ژلهاي لوله اي دارند. "IEF" بر روي نوارهاي "IPG" با قطر 3 يا 5 ميليمتر انجام مي شود. نمونه ها را مي توان توسط جامهاي كوچك يا خيساندن در روي ژل به ژل افزود. بعد از "IEF" نوارهاي "IPG" توسط بافر "SDS" متعادل سازي مي شوند و بعد از آن بصورت افقي يا عمودي بر روي ژلهاي "SDS" در بعد دوم قرار داده مي شوند.
روشهايي براي آماده سازي دستي اين ژلها وجود دارد كه البته اكنون از اين روشها به ندرت استفاده مي شود و بيشتر نوارهاي "IPG" آماده مصرف مي شوند. اما در روشهاي دستي ژلهاي تخت "IPG" با محدودة pH مورد نظر بر روي ورقه هايي شفاف (Gel Bound tagged films) ريخته مي شوند كه ژل پلي آکريل آميد به خوبي به آنها متصل مي شود. ژلها بعد از پليمريزه شدن کاملا" با آب ديونيزه شسته مي شوند؛ يعني شش بار و هر بار به مدت 10 دقيقه در آب ديونيزه و بعد در گليسرول 2% به مدت 30 دقيقه غوطه ور مي شوند و سپس در دماي اتاق در نقطه اي كه عاري از هرگونه گرد و غباري باشد, قرار داده مي شوند تا خشك گردند و روي آنها با ورقه اي پلاستيكي پوشيده مي شود. در صورت عدم تمايل به استفاده سريع از اين ژلها مي توان آنها را به مدت يك سال در 20- درجه نگهداري كرد. قبل از استفاده، ژلها به نوارهاي 5-3 ميلي متري بريده مي شوند. همانطور كه ذكر شد نوارهاي "IPG" از پيش آماده در بازار موجود هستند. اين نوارها در طولهاي متفاوت بوده، و هر چه ميدان طول نوارها بلندتر باشد, تعداد پروتئينهايي كه مي توانند از هم تفكيك گردند بيشتر خواهد بود. نوارهاي 18 يا 24 سانتيمتري معمولاً براي جداسازي با قدرت تفكيك بالا استفاده مي شوند درحاليكه نوارهاي كوتاهتر 7 يا 11 سانتيمتري براي غربالگري سريع نمونه ها مورد استفاده قرار مي گيرند.

[Borna66]

ساختمان شيميا يي لیپیدها
ليپيدها با اينكه مانند كربو هيدراتها از عنا صر كربن ، هيدرو ژن و اكسيژنتشكيل شده اند ، ولي چون تعداد اكسيژن آن در مقايسه با هيدروژن و كربن كمتر است ،‌از اين نظر با كربو هيدراتها تفا وت دارند . اين بدان معناست كه در اثر اكسيداسيون چربي موجود در غذا ، تعداد كمتري كربن و هيدروژن اكسيده مي شوند در نتيجه وقتي كه اين عناصر در داخل يا خته هاي بدن تحت عمل اكسيداسيون قرار مي گيرند ، قدرت بيشتري براي آزاد كردن انرژي دارند .

قسمت اعظم چربي هاي موجود در غذاها از يك گليسرول سه مو لكول اسيد چرب تشكيل شده است .ساختمان گليسرول كه يك الكل سه ظرفيتي است در زير نشان داده ميشود.

قسمت گليسرولي تمام مولكولهاي چربي يكي است ، ولي نوع و تعداد اسيدهاي چرب متصل به گليسرول ، در مولكول چربي متغير است .اسيدهاي چرب موجود در غذاها نوعي از تركيباتي كربني با زنجيره اي مستقيم مي باشند كه اكثر آنها داراي تعداد زوجي كربن هستند كه به هر كربن ، دو اتم هيدروژن متصل است و در يك انتهاي اسيد ، گروه متيل و در طرف ديگر آن گروه كربوسيل ( COOH) قرار دارد . نمونه يك اسيد چرب ساده به صورت زير است :

CH- CH CH CH COOH

فرمول كلي اسيدهاي چربCH-CH-COOH است كه n عدد زوجي است و از 2 تا 24 متغير است . اغلب چربي هاي طبيعي شامل اسيدهاي چرب با زنجيره طولاني متوسط 8 تا 12 كربني و با زنجيره كوتاه 2 تا 6 كربني مي شوند . براي مثال ، شير داراي 4% كره 8% و روغن نارگيل 10% اسيد چرب با زنجيره متوسط مي باشد.

اسيدهاي چرب با زنجيره كوتاه ، از اسيدهاي چرب با زنجيره طولاني محلول ترند. همچنين اين اسيدها سريع تر جذب مي شوند و به جريان خون انتقال مي يا بند.

نحوه اتصال اسيد چرب به گليسرول به اين طريق است كه قسمت OH مولكول گليسرول باH گروه كربوكسيل به هم متصل مي شوند ، در نتيجه يك مولكول آب توليد مي كنند و بقيه اسيد چرب به اكسيژن باقي مانده مولكول گليسرول مي چسبد.

اسيدهاي چرب نه تنها از نظر طول زنجيره ها با هم تفاوت دارندبلكه درجه اشباع آنها با اتم هاي هيدروژن نيزمتفاوت است . در يك ايد چرب اشباع ، به هر اتم كربن داخل زنجيره 2 اتم هيدروژن متصل است، و اين بالا ترين تعدادي است كه مي تواند داشته باشد . در بعضي از اسيدهاي چرب مانند با يك درجه غير اشباع دو كربن مجاور هر يك فاقد هيدروژن مي باشند، در نتيجه چون هر دو داراي يك ظرفيت غير اشباع مي باشند، از طريق ظرفيت دوم خود به يكديگر متصل مي شوند كه اين نوع اتصال را پيوند دو گانه مي نامند . بنا براين به جاي داشتن اين شكل:

اگر زنجيره كربني به جاي يك پيوند دو گانه ، شامل دو يا بيشتر از آن باشد آن را اسيد چرب غير اشباع با چند پيوند دو گانه (PUFA ) مي نامند. اگر اسيدهاي چرب اشباع شده يا اسيدهاي چرب با زنجيره طولاني موجود در چربي يشتر از تعداد اسيدهاي چرب با زنجيره كوتاه باشد ، آن چربي نقطه ذوب بالاتري دارد و در درجه حرارت معمولي به حالت جامد است . اسيدهاي چرب اشباع نشده با چند پيوند دو گانه تقرباً 40% چربي رژيم غذايي و اسيدهاي چرب اشباع نشده با پيوند دو گانه 12% (در روغن دانه سويا 70% آن) و اسيدهاي چرب اشباع شده 37% كل چربي رژيم غذايي را تشكيل مي دهند . نسبت تعداد اسيدهاي چرب اشباع نشده با پيوند دو گانه به اسيدهاي چرب اشباع شده به صورت P/S مشخص مي شود اين نسبت در برنامه غذايي آمريكا بتدريج افزايش يافته است به طوري كه آن را تا33% تخمين زده اند .اين نسبت نشان مي دهد كه3/1 اسيدهاي چرب تشكيل ذهنده اسيدهاي چرب اشباع نشده چند پيوند دو گانه دارد

معمولي ترين اسيدهاي چرب اشباع در غذاها عبارتند از : اسيد بوتيريك ( 4 كربن ) ، اسيد پالمتيك (16 كربن ) و اسيد استئاريك ( 18 كربن ) .

اسيد اولئيك ، اسيد چربي است كه داراي هجده كربن و يك پيوند دو گانه است . اسيد لينو لئيك ، از معمولي ترين اسيدهاي چرب غيرز اشباع با چند پيوند دو گانه دارد ، و تقريباً 75 % اسيدهاي چرب موجود در روغن گلرنگ ، 54 % در روغن ذرت و 2 % اسيدهاي چرب موجود در كره را تشكيل مي دهد . به طور واضح تمام چربيها ويژگيهاي مشابهي ندارند ، مثلاً مشخصات چربي كره با چربي گوشت گاو ، و چربي گوشت جوجه با روغن ذرت متفاوت است. چربي هر حيوان به مشخصات مخصوص به نوع آن حيوان بستگي دارد . به طوري كه چربي گوشت جوجه به راحتي از چربي

گوشت گاو كه جامد تر است ، و چربي گوشت گاو از چربي گوشت گوسفند كه سخت و سفيد است ، قابل تشخيص ميباشد خصو صيات چربي حيواناتي كه نشخوار نمي كنند ، با تغيير غذاي آنها تغيير خواهد كرد . توليد كنندگان از اين خاصيت استفاده كرده اند ، و نوع چربي مورد نياز مشتري را به بازار عرضه مي كنند . براي مثال ، خوكهايي كه با بادام زميني تغذيه مي شوند چربي نرمي دارند كه به ذائقه مردم بعضي از مناطق خوش نمي آيد ، در حالي كه مردم برخي مناطق اين نوع چربي را از چربي سخت كه در اثر تغذيه خوك با ذرت توليد ميشود ، بيشتر دوست دارند . چربيهايي كه از كربو هيدرات +تهيه مي شوند احتمالاً بيشتر از نوع اشباع هستند .

بنا بر اين سخت تر از چربيهايي مي باشند كه از پروتئين يا چربي بدست مي آيند .

نوع و تعداد اسيدهاي چرب و ترتيب قرار گرفتن آنها در چربي ، خصو صيات متفاوتي در چربيها به وجود مي آورد . به طوري كه اسيد چرب ممكن است 4تا 26 كربن داشته باشد و اشباع شده يا اشباع نشده با يك يا چند پيوند دو گانه باشد. همچنين بجز انواع مختلف اسيدهاي چرب ، تعداد آنها نيز در خصو صيات چربي تاثير مي گذارد . بيش از 98 % از چربي غذاها و 20 % چربي كبد و خون از تري گليسريدها تشكيل شده اند . سه محل مناسب در مولكول گليسرول به اسيد چرب متصل شده است كه اين سه اسيد ممكن است از يك نوع باشند ، مانند تري گليسريدهاي ساده ، يا اينكه تري گليسيريد از سه اسيد مختلف شده باشد ، و همچنين ممكن است دو اسيد آن ،از ييك نوع با شند . اغلب چربيها شامل حداقل دو نوع اسيد چرب متفاوت مي باشند كه به تري گليسيريد هاي مختلط معرو فند . تري گليسيريد هايي كه در ييك چربي غذايي وجود دارند همه از يك نوع چربي نيستند . مثلاً در چربي شير 140 اسيد چرب شنا خته شده است كه شامل 125000 تري گليسيريد متفاوت مي باشد . وقتي تعداد اسيد هاي چرب موجود در يك مولكول چربي ببه دو يا بيشتر برسد ، ترتيب قرار گرفتن آنها روي خصو صيات چربي اثر مي گذارد .

2 % چربي با قيمانده موجود در غذا مركب است از منو گليسيريدها ، كه مولكول گليسيرل فقط به يك اسيد چرب متصل شده و دي گليسيريدها ، كه گليسيرول به دو اسيد چرب اتصال يافته است ، و فسفو ليپيدها كه در آنها گليسيرل با يك فسفات و مواد ازت دار ، جانشين يكي از اسيدهاي چرب تري گليسيريد شده است . همه اينها به عنوان امو لسيون كننده عمل مي كنند تا چربي را به يك شكل كاملاً يكنواخت در آورند . اغلب ، اين مواد را به همين منظور ببه غذاها مي افزايند .

[Borna66]

انواع روشهاي بلاتينگ
به طور کلی در ژنتیک مولکولی به عمل انتقال مولکولهای تفکیک شده در الکتروفورز از ژل به روی یک غشاء ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود. معنای واژهٔ انگلیسی بلاتینگ، لکه‌گذاری است.

برای انجام اعمالی مانند هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک و شناسایی پروتئینها با پادتن‌ها، ژل محیط مناسبی نیست. علت اصلی این مسئله نفوذپذیری کم ژل و خروج شناساگرها (Probe) از ژل می‌‌باشد. از اینرو در صورت انجام عمل آشکارسازی به کندی و با مشکل صورت می‌‌گیرد. اما غشاء، محیط مناسبی برای اعمال فوق فراهم می‌‌کند.

سادرن بلاتینگ
برای انتقال مولکولهای DNA از ژل به غشاء از روشی استفاده می‌شود که سادرن بلاتینگ نام دارد (در فارسی اشتباهاً ساترن بلاتینگ هم نوشته شده). این روش ابتدا توسط ادوین سادرن از دانشگاه آکسفورد ابداع شد. در این روش از خاصیت موئینگی، برای انتقال مولکولهای DNA استفاده می‌شود. اصول این روش به این صورت است که پس از تفکیک مولکولها بر روی ژل، آن را در محلول هیدرو کسید سدیم قرار داده تا مولکولهای DNA دو رشته‌ای واسرشت شوند. درصورتیکه که ژل حاوی مواد واسرشت کننده باشد نیازی به این مرحله نیست. سپس ژل برروی سکویی که دریک ظرف حاوی بافر قرار دارد، منتقل نموده و بر روی آن غشاء نیتروسلولز قرار می‌‌دهند. بر روی غشاء مزبور چندین لایه کاغذ نمگیر قرار داده می‌شود. این لایه‌ها باعث برقراری جریان بافر به سمت بالا می‌شود از ژل به غشا می‌‌شوند. همراه با جریان بافر، مولکولهای DNA از ژل خارج شده و بر روی غشاء نیتروسلولزی یا نایلونی قرار می‌‌گیرند. غشاء هائی که برای این منظور به کار گرفته می‌‌شوند کاملا اختصاصی بوده ودارای بار الکتریکی مثبت می‌‌باشند، در نتیجه مولکولهای اسید نوکلئیک به طور محکم به انها متصل می‌‌شوند.

نوردرن بلاتینگ
از آنجا که RNA به سختی به کاغذهای نیتروسلولزی متصل می‌شود، از روش سادرن نمی‌توان برای مولکولهای RNA استتفاده کرد. برای انتقال مولکولهای RNA از روشی بنام نوردرن بلاتینگ استفاده می‌شود. اساس این روش مشابه روش سادرن بلاتینگ است. با این تفاوت که در آن از کاغذهای فعال شده یا کاغذهای DBM، استفاده می‌شود. این کاغذها را می‌‌توان به راحتی با تیمارهای شیمیایی خاصی از کاغذ صافی تهیه کرد. در این روش، به علت تک رشته‌ای بودن RNA و تفکیک آن بر روی ژل واسرشت کننده نیازی به مرحله مجاورت با هیدرکسید سدیم نمی‌باشد. در ضمن به علت حساس بودن مولکولهای RNA دقت بیشتری در انجام مراحل لازم می‌‌باشد.

وسترن بلاتینگ
برای انتقال پروتئینهای تفکیک شده بر روی ژل به غشاء از تکنیک وسترن بلاتینگ استفاده می‌شود. این روش نیز مشابه روش سادرن بلاتینگ می‌‌باشد با این تفاوت که جریان بافر به صورت افقی است. اخیرا روشهای بلاتینگ جدیدی از ترکیب روشهای بالا ابداع شده اند. از جمله این روشها روش بلاتینگ جنوب غربی و بلاتینگ شمال غربی را می‌‌توان نام برد. روش اول برای انتقال پروتئینهایی که به DNA متصل می‌‌شوند استفاده می‌شود و روش دوم برای پروتئینهایی که به RNA متصل می‌‌شوند، به کار گرفته می‌شود.

[Borna66]

حامل هاي آمفولايتي در الكتروفورز
حامل هاي آمفولايتي با به حداقل رساندن پديده ي توده شدن پروتئين ها از طريق ايجاد بر هم کنش هاي ناشي از بارهاي الکتريکي موجود بر روي پروتئين ها باعث افزايش حل پذيري آنها مي شوند.

يکي از اساسي ترين چالش هاي "ief " تمايل زياد برخي پروتئينها به رسوب در نقطة ايزوالكتريكشان است. در برخي از نمونه ها پروتئينها يي وجود دارند که براي حفظ حلاليتشان, حتي در حضور دترجنتها, نياز به وجود نمك دارند. اين امر مشكل ساز است, زيرا هرگونه نمكي كه در محلول وجود داشته باشد, در حين جريان بالايي که در ابتداي "ief" اِعمال مي شود از ژل خارج مي شود. بدين ترتيب پروتئينهايي که براي حلاليت خود نياز به نمک دارند با خارج شدن آن رسوب مي کنند. از طرفي ديگر, وجود نمك باعث محدود كردن ولتاژي مي گردد كه مي توان بدون ايجاد جريان بسيار بالا به آن دست يافت, و اين امر سبب افزايش زمان فوكوسينگ خواهد شد. نمك تنها درصورتي بايد در يك نمونه حضور داشته باشد كه نياز اساسي به حضور آن باشد و در اين صورت تنها غلظت تام كمتر از 40 ميلي مولار قابل قبول است. حامل هاي آمفولايتي براي جبران از دست رفتن نمک در اين نمونه ها عمل مي کنند. اين حامل ها معمولاً در غلظتي كمتر از 2 دهم درصد به کا رگرفته مي شوند, چرا که در غلظت هاي زياد, تا زماني كه در نقطة ايزوالكتريك خود فوكوس شوند, سبب كاهش سرعت "ief" مي شوند چرا که حامل جريان مي باشند و اين امر سبب محدود شدن ولتاژ مي گردد.