Borna66
04-10-2009, 05:06 PM
محلول سازي
در نظر گرفتن ماهيت نمونه, در انتخاب راهکار مناسب براي محلول ساختن پروتئين هاي موجود در نمونه بسيار مهم است. در صورتيکه نمونه مورد نظر از منابع سلولي يا بافتي استخراج شود اولين قدم ليز سلولها و خارج ساختن محتواي پروتئيني آنهاست. روشهاي متفاوت مکانيکي و شيميايي درليز و متلاشي ساختن سلولها به کار گرفته مي شود. اين روشها ممکن است روش هاي ملايمي چون شکست ديواره ي سلولهاي باکتريايي توسط آنزيم لايزوزايم "Lysozyme", يا روشهاي خشني چون استفاده از پِرِس فرانسوي "French Press" براي متلاشي ساختن سلولهاي مخمري باشد.
به هر حال در روش مطلوبِ محلول سازي براي الكتروفورز دو بعدي بايد تمام پيوندهاي غيركوالانت در كمپلكسهاي پروتئيني شكسته شده و تجمع هاي پروتئيني به پلي پپتيدهاي منفرد و محلول تبديل شوند. به علاوه روش محلول سازي بايد اجازه ي خارج ساختن موادي نظير نمكها، ليپيدها، پلي ساكاريدها، و اسيدهاي نوكلئيك را كه مي توانند باعث اختلال درجداسازي توسط الكتروفورز دوبعدي شوند، بوجود آورد. درنهايت پروتئينهاي نمونه بايد درحين روند الكتروفورز دوبعدي محلول باقي بمانند. به همين دلايل محلول شدن نمونه يكي از عوامل بسيار حساس براي جداسازي پروتئينها توسط الكتروفورز دو بعدي است .
در اين قسمت ابتدا به روشهاي متداول در ليز و متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتئيني آنها مي پردازيم. سپس اجزاي موثر در روند محلول سازي را مورد بررسي قرار خواهيم داد.
3-3-1- روشهاي متلاشي ساختن سلولها
روشهاي متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتيني آنها, دامنه وسيعي از روش هاي فيزيکي و شيميايي ملايم تا خشن را در بر مي گيرد. ممکن است ليز سلولي به طور مستقيم در تماس با بافر محلول سازي صورت پذيرد يا در مواردي ممکن است از امواج مافوق صوت "Sonication" براي اين منظور استفاده شود. حتي در برخي موارد ترکيبي از روشهاي مختلف براي نيل به استخراج کامل پروتئين هاي نمونه استفاده مي گردد.
متلاشي ساختن نمونه ها بايد در سرما صورت پذيرد و نمونه مورد نظر در حين اين روند بايد روي يخ نگهداري شود. براي حفظ نمونه ي پروتئيني از عملکرد پروتئازهاي آزاد شده در حين متلاشي ساختن سلولها بايد تمهيداتي در نظر گرفته شود. يکي از روش هاي معمول متلاشي ساختن مستقيم سلولها در محلولهاي ليز کننده اي است که سريعا" پروتئازها و ديگر فعاليت هاي آنزيمي را متوقف کنند, اين محلولها عموما" داراي مواد دناتوره کننده ي قدرتمندي هستند.
بافرهاي محلول سازي
بافرهاي محلول سازي ممکن است به تنهايي يا در ترکيب با روشهاي ديگر متلاشي سازي سلولي به کار گرفته شوند. براي انجام جداسازي مناسب در بعد اول, نمونه هاي پروتئيني بايد بايد کاملا" غير توده اي و به صورت محلول باشند. اين امر براي تمامي انواع نمونه ها در هر مرحله اي از آماده سازي ضروري است. براي اين منظور معمولا", در ترکيب بافرهاي محلول سازي از يک يا دو معرف کائوتروپيک, دترجنت, معرف احيا کننده, و آمفولايت استفاده مي شود.
در اين قسمت به معرفي اين اجزا و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازي نمونه براي انجام الکتروفورز دو بعدي مي پردازيم.
3-3-2-1- معرفهاي کائوتروپيک
بسياري از پروتئين ها در اشکال طبيعي (Native) داراي چندين شكل فضايي مختلف هستند و به همين دليل ممکن است در الکتروفورز دو بعدي الگوهاي پيچيده اي ايجاد کنند. اين وضعيت تفسير نمايه هاي دو بعدي را دچار مشکل خواهد کرد. براي ساده تر کردن نمايه دو بعدي و حذف اثر شکل فضايي در ايجاد نقاط متعدد مربوط به يک پروتئين و ايجاد شکلي منفرد از آن, برهم زدن شکل طبيعي (Denaturing) توسط معرفهاي کائوتروپيک انجام مي شود.
اوره مهمترين عامل كائوتروپيك در آماده سازي نمونه براي الکتروفورز دو بعدي است که معمولاً با غلظت 8 مولار استفاده مي شود. اوره از دو طريق مستقيم و غير مستقيم باعث بر هم زدن شکل طبيعي و باز شدن تاخوردگي (Unfolding) مولکولهاي پروتئيني مي شود. مولکولهاي اوره مستقيما" جذب گروه هاي آب دوست (Hydrophill) و قطبي در سطح پروتئين ها مي شوند. اين مولکولهاي جذب شده به گروه هاي قطبي, اثر دفعي بر يکديگر دارند. بر اثر اين نيروي دفعي موجود در سطح, مولکول پروتئين باز شده و متورم مي گردد. همين امر گروه هاي آب گريز در سطوح داخلي پروتئين را در معرض محيط خارجي قرار مي دهد. ورود آب و اوره به محيط داخلي پروتئين سبب ايجاد بي ثباتي و برهم زدن شکل طبيعي پروتئين مي شود.
از طرف ديگر, اوره از طريقي غير مستقيم و با تغيير در ساختار و ديناميک آب مي تواند در برهم زدن شکل طبيعي پروتئين نيز موثر باشد. حضور مواد غير قطبي باعث اختلال در شبکه ي پيوندهاي هيدروژني بين مولکولهاي آب شده و ايجاد فضايي خالي در بين مولکولهاي آب مي نمايد, اين کاهش نامطلوب در انتروپي با فشار مولکولهاي آب به مولکولهاي آب گريز جبران مي شود تا کمترين فضاي ممکن را اشغال نمايند. اين پديده به اثر آب گريزي (Hydrophobic effect) موسوم است. اوره در غلظت هاي بالا, 8-6 مولار, نيروهاي موثر در متراکم کردن ساختمان پروتئين ها به خصوص اثر آب گريزي را کاهش مي دهد. بدين ترتيب به طور غير مستقيم قسمت هاي مرکزي آب گريز را در معرض و دسترسي عوامل محيطي قرار مي دهد.
زماني كه به شرايط كائوتروپيكي قوي نياز باشد ، تركيبي از تيواوره 2 مولار و اوره 8-5 مولار مورد استفاده قرار مي گيرد. تيواوره در مقايسه با اوره ماده ي دناتوره كننده ي بسيار قوي‌تري است. اما نمي توان آن را به تنهايي مورد استفاده قرار داد، چراكه حلاليت بسيار كمي در آب دارد. اين ماده در محلول غليظ اوره حلاليت بيشتري دارد. به همين دليل مخلوط هاي اوره ـ تيواوره قدرت محلول كنندگي بهتري را از خود نشان مي دهند. به علاوه اين تركيب قادر به جلوگيري از فعاليت آنزيمهاي پروتئوليتيك نيز هست كه در حضور اوره به تنهايي هم ممکن است فعّال باقي بمانند.
درجة خلوص اوره بسيار مهم است و بايد از حرارت دادن آن, به دليل تشكيل ايزوسيانات كه از تجزيه اوره حاصل مي شود، خودداري کرد. ايزوسيانات باعث كرباميلاسيون پروتئين ها و تشكيل نقاط غيرواقعي در الگوي نهايي دو بعدي مي شود. محلول حاوي اوره پايدار نيست و از ذوب و انجماد مكرر محلول حاوي اوره بايد خودداري كرد. از طرفي ديگر, اگرچه استفاده از تيواوره در نمونه باعث افزايش در بروز نقاط پروتئيني در نقشه پروتئيني مي شود اما ايجاد رگه هاي (Streaking) عمودي و نقاط مبهم و نامشخص در ناحية اسيدي ژل را نيز سبب مي شود كه هنوز راه حل مناسبي جهت حذف اين زوايد پيدا نشده است.
در نظر گرفتن ماهيت نمونه, در انتخاب راهکار مناسب براي محلول ساختن پروتئين هاي موجود در نمونه بسيار مهم است. در صورتيکه نمونه مورد نظر از منابع سلولي يا بافتي استخراج شود اولين قدم ليز سلولها و خارج ساختن محتواي پروتئيني آنهاست. روشهاي متفاوت مکانيکي و شيميايي درليز و متلاشي ساختن سلولها به کار گرفته مي شود. اين روشها ممکن است روش هاي ملايمي چون شکست ديواره ي سلولهاي باکتريايي توسط آنزيم لايزوزايم "Lysozyme", يا روشهاي خشني چون استفاده از پِرِس فرانسوي "French Press" براي متلاشي ساختن سلولهاي مخمري باشد.
به هر حال در روش مطلوبِ محلول سازي براي الكتروفورز دو بعدي بايد تمام پيوندهاي غيركوالانت در كمپلكسهاي پروتئيني شكسته شده و تجمع هاي پروتئيني به پلي پپتيدهاي منفرد و محلول تبديل شوند. به علاوه روش محلول سازي بايد اجازه ي خارج ساختن موادي نظير نمكها، ليپيدها، پلي ساكاريدها، و اسيدهاي نوكلئيك را كه مي توانند باعث اختلال درجداسازي توسط الكتروفورز دوبعدي شوند، بوجود آورد. درنهايت پروتئينهاي نمونه بايد درحين روند الكتروفورز دوبعدي محلول باقي بمانند. به همين دلايل محلول شدن نمونه يكي از عوامل بسيار حساس براي جداسازي پروتئينها توسط الكتروفورز دو بعدي است .
در اين قسمت ابتدا به روشهاي متداول در ليز و متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتئيني آنها مي پردازيم. سپس اجزاي موثر در روند محلول سازي را مورد بررسي قرار خواهيم داد.
3-3-1- روشهاي متلاشي ساختن سلولها
روشهاي متلاشي ساختن سلولها به منظور استخراج محتواي پروتيني آنها, دامنه وسيعي از روش هاي فيزيکي و شيميايي ملايم تا خشن را در بر مي گيرد. ممکن است ليز سلولي به طور مستقيم در تماس با بافر محلول سازي صورت پذيرد يا در مواردي ممکن است از امواج مافوق صوت "Sonication" براي اين منظور استفاده شود. حتي در برخي موارد ترکيبي از روشهاي مختلف براي نيل به استخراج کامل پروتئين هاي نمونه استفاده مي گردد.
متلاشي ساختن نمونه ها بايد در سرما صورت پذيرد و نمونه مورد نظر در حين اين روند بايد روي يخ نگهداري شود. براي حفظ نمونه ي پروتئيني از عملکرد پروتئازهاي آزاد شده در حين متلاشي ساختن سلولها بايد تمهيداتي در نظر گرفته شود. يکي از روش هاي معمول متلاشي ساختن مستقيم سلولها در محلولهاي ليز کننده اي است که سريعا" پروتئازها و ديگر فعاليت هاي آنزيمي را متوقف کنند, اين محلولها عموما" داراي مواد دناتوره کننده ي قدرتمندي هستند.
بافرهاي محلول سازي
بافرهاي محلول سازي ممکن است به تنهايي يا در ترکيب با روشهاي ديگر متلاشي سازي سلولي به کار گرفته شوند. براي انجام جداسازي مناسب در بعد اول, نمونه هاي پروتئيني بايد بايد کاملا" غير توده اي و به صورت محلول باشند. اين امر براي تمامي انواع نمونه ها در هر مرحله اي از آماده سازي ضروري است. براي اين منظور معمولا", در ترکيب بافرهاي محلول سازي از يک يا دو معرف کائوتروپيک, دترجنت, معرف احيا کننده, و آمفولايت استفاده مي شود.
در اين قسمت به معرفي اين اجزا و نقش آنها در محلول ساختن و آماده سازي نمونه براي انجام الکتروفورز دو بعدي مي پردازيم.
3-3-2-1- معرفهاي کائوتروپيک
بسياري از پروتئين ها در اشکال طبيعي (Native) داراي چندين شكل فضايي مختلف هستند و به همين دليل ممکن است در الکتروفورز دو بعدي الگوهاي پيچيده اي ايجاد کنند. اين وضعيت تفسير نمايه هاي دو بعدي را دچار مشکل خواهد کرد. براي ساده تر کردن نمايه دو بعدي و حذف اثر شکل فضايي در ايجاد نقاط متعدد مربوط به يک پروتئين و ايجاد شکلي منفرد از آن, برهم زدن شکل طبيعي (Denaturing) توسط معرفهاي کائوتروپيک انجام مي شود.
اوره مهمترين عامل كائوتروپيك در آماده سازي نمونه براي الکتروفورز دو بعدي است که معمولاً با غلظت 8 مولار استفاده مي شود. اوره از دو طريق مستقيم و غير مستقيم باعث بر هم زدن شکل طبيعي و باز شدن تاخوردگي (Unfolding) مولکولهاي پروتئيني مي شود. مولکولهاي اوره مستقيما" جذب گروه هاي آب دوست (Hydrophill) و قطبي در سطح پروتئين ها مي شوند. اين مولکولهاي جذب شده به گروه هاي قطبي, اثر دفعي بر يکديگر دارند. بر اثر اين نيروي دفعي موجود در سطح, مولکول پروتئين باز شده و متورم مي گردد. همين امر گروه هاي آب گريز در سطوح داخلي پروتئين را در معرض محيط خارجي قرار مي دهد. ورود آب و اوره به محيط داخلي پروتئين سبب ايجاد بي ثباتي و برهم زدن شکل طبيعي پروتئين مي شود.
از طرف ديگر, اوره از طريقي غير مستقيم و با تغيير در ساختار و ديناميک آب مي تواند در برهم زدن شکل طبيعي پروتئين نيز موثر باشد. حضور مواد غير قطبي باعث اختلال در شبکه ي پيوندهاي هيدروژني بين مولکولهاي آب شده و ايجاد فضايي خالي در بين مولکولهاي آب مي نمايد, اين کاهش نامطلوب در انتروپي با فشار مولکولهاي آب به مولکولهاي آب گريز جبران مي شود تا کمترين فضاي ممکن را اشغال نمايند. اين پديده به اثر آب گريزي (Hydrophobic effect) موسوم است. اوره در غلظت هاي بالا, 8-6 مولار, نيروهاي موثر در متراکم کردن ساختمان پروتئين ها به خصوص اثر آب گريزي را کاهش مي دهد. بدين ترتيب به طور غير مستقيم قسمت هاي مرکزي آب گريز را در معرض و دسترسي عوامل محيطي قرار مي دهد.
زماني كه به شرايط كائوتروپيكي قوي نياز باشد ، تركيبي از تيواوره 2 مولار و اوره 8-5 مولار مورد استفاده قرار مي گيرد. تيواوره در مقايسه با اوره ماده ي دناتوره كننده ي بسيار قوي‌تري است. اما نمي توان آن را به تنهايي مورد استفاده قرار داد، چراكه حلاليت بسيار كمي در آب دارد. اين ماده در محلول غليظ اوره حلاليت بيشتري دارد. به همين دليل مخلوط هاي اوره ـ تيواوره قدرت محلول كنندگي بهتري را از خود نشان مي دهند. به علاوه اين تركيب قادر به جلوگيري از فعاليت آنزيمهاي پروتئوليتيك نيز هست كه در حضور اوره به تنهايي هم ممکن است فعّال باقي بمانند.
درجة خلوص اوره بسيار مهم است و بايد از حرارت دادن آن, به دليل تشكيل ايزوسيانات كه از تجزيه اوره حاصل مي شود، خودداري کرد. ايزوسيانات باعث كرباميلاسيون پروتئين ها و تشكيل نقاط غيرواقعي در الگوي نهايي دو بعدي مي شود. محلول حاوي اوره پايدار نيست و از ذوب و انجماد مكرر محلول حاوي اوره بايد خودداري كرد. از طرفي ديگر, اگرچه استفاده از تيواوره در نمونه باعث افزايش در بروز نقاط پروتئيني در نقشه پروتئيني مي شود اما ايجاد رگه هاي (Streaking) عمودي و نقاط مبهم و نامشخص در ناحية اسيدي ژل را نيز سبب مي شود كه هنوز راه حل مناسبي جهت حذف اين زوايد پيدا نشده است.