Borna66
04-10-2009, 04:43 PM
مباني الکتروفورز
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.
در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل 5-1).
شکل 5-1- شمايي از سيستم الکتروفورز
جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.
5-1-1-1- اثر عوامل الکتريکي
در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 5-1)
V=IR
معادله 5-1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است
معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند.
P=V2/R يا P=I2R يا P=VI
معادله 5-2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.
اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد (جدول 5-1). براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.
جدول 5-1- تاٍثير ثابت نگاه داشتن پارامترهاي الکتريکي در سيستم هاي بافري مختلف
انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود.
5-1-1-1- اثر سيستم هاي بافري و pH
پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.
5-1-1-2- اثر حرارت
براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم � شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.
5-2- الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.
اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.
درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.
اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.
مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.
رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
5-2-1- نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل 5-2).
شکل 5-2- نحوه ي پلي مريزاسيون آکريل آميد
پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.
راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.
اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.
بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است
نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.
الكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. به همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
معمولا" براي الکتروفورز يک مخلوط مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند. اين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.
در اغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل 5-1).
شکل 5-1- شمايي از سيستم الکتروفورز
جداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند.
5-1-1-1- اثر عوامل الکتريکي
در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقيم با اختلاف پتانسيل اِعمال شده دارد. قانون اُهم Ohm در الکتروفورز از اهميت زيادي برخوردار است (معادله 5-1)
V=IR
معادله 5-1- قانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است
معادله فيزيکي ديگر که از آهميت برخوردار است, معادله توان است. اين معادله مقدار حرارت ايجاد شده در حين الکتروفورز را مشخص مي کند.
P=V2/R يا P=I2R يا P=VI
معادله 5-2- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.
اين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند. بايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد (جدول 5-1). براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند.
جدول 5-1- تاٍثير ثابت نگاه داشتن پارامترهاي الکتريکي در سيستم هاي بافري مختلف
انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود.
5-1-1-1- اثر سيستم هاي بافري و pH
پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH محلول هاي مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند.
5-1-1-2- اثر حرارت
براي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم � شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد.
5-2- الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
اكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود.
اساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند.
درسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند.
اين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد.
مزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند.
رديف شدن ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود. بنابراين ژل رديف کننده قادر است پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
5-2-1- نحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
ژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل 5-2).
شکل 5-2- نحوه ي پلي مريزاسيون آکريل آميد
پليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد.
راديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود.
اندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C.
بدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است
نکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود.