Borna66
04-10-2009, 04:42 PM
روشهاي متفاوت در آشکارسازي ژل هاي الکتروفورز دو بعدي به فنون تصويربرداري خاص خود نياز دارند. اين فنون بايد قادر به تشخيص علائم کروموژنيک مختلف و علائم فلورسانت باشند براي اين منظور از دستگاه هاي مختلفي چون اسکنر اسناد Document scanner, دوربين CCD Charged �coupled device camera, و دانسيتومترهاي ليزري استفاده مي شود.
با توجه به تعداد نقاط بسيار زياد ةاهر شده بر روي ژل الکتروفورز دو بعدي, بهترين روش آناليز با استفاده از کامپيوتر صورت مي پذيرد. با استفاده از ابزار کامپيوتري مي توان حتي نقاط کمرنگ را تشخيص داد و تعيين اندازه کرد, تصاوير ژل هاي متفاوت را با يکديگر مقايسه نمود و تغييرات کمي بيان پروتئين ها را در ژل هاي تهيه شده از يک نمونه در شراطي متفوت را مشخص نمود. چندين نرم افزار مطرح براي چنين کاربردي در بازار موجود است:Z3 ساخت Compugen, Melanie V از Genbio و Amersham و PD Quest از BioRad. تمامي اين نرم افزارها ابتدا تصوير ژل را در برنامه نشان مي دهندو قادر به ويراستن تصاوير در قالب TIFF هستند. سپس اين نرم افزارها به تشخيص نقاط مي پردازند, اطنکار به صورت خودکار صورت گرفته و قابليت ويراستاري دستي را دارند. با تنظيم نحوه ي تشخيص نقاط مي توان اين نحوه را براي يک سري از ژلها اعمال کرد. بعد از اين مرحله نرم افزارها شروع به تطابق نقاط يکسان بر روي يک سري از ژل هاي مورد نظر و انتخاب شده مي نمايند. اولين مرحله در اين کار تعيين يکي از ژل ها به عنوان ژل مرجع است. در ژل مرجع چندين نقطه ي پروتئيني به عنوان نقاط اصلي به منظور پيدا کردن جفت هاي يکسان آنها بر روي ژل هاي ديگر تعيين مي شوند. سپس تطابق نقاط جفت شروع مي شود. با انجام اين مرحله نطابق کل نقاط ژل ها شروع خواهد شد. بعد از اين مرحله ويراستاري و تصحيح دقيق تطابق هاي انجام شده صورت مي گيرد. اين مرحله براي افزايش دقت در مقايسه بين ژل ها ضروري است. يکي از توانايي هاي اين نرم افزارها امکان ايجاد ژلهاي مصنوعي يا ژلهاي ميانگين Average gels با استفاده از ژلهاي تطابق يافته حاصل از يک نمونه در يک وضعيت مشخص است. اين ژلهاي ميانگين براي بررسي تغييرات در بيان پروتئين در بين دسته هاي مختلف ژلها بسيار کار آمد هستند.
برخي مواقع در تصاوير ژلهاي الکتروفورز دو بعدي اختلاف در شدت نقاط ناشي از اختلاف در بيان پروتئين ها نيست, بلکه اختلاف در آماده سازي نمونه, ميزان بارگيري, نحوه ي رنگ آميزي و حتي تصوير برداري موجد اين اختلاف است. درچنين مواردي نرم افزار ها قادر به نرماليزه کردن تصاويز برای جبران اين اختلاف در شدت نقاي هستند. اينکار توسط رجوع به نقاطي مي شود که از عدم تغيير در ميزان آنها در طي آزمايشهاي مختلف اطمينان وجود دارد.
در نهايت آناليز اطلاعات شروع خواهد شد. در ابتدا نقاطي نشان داده مي شوند که براي آنها ويژگي خاصي تعريف شده باشد, مثلا" نقاي تطابق يافته اي که بيش از دو برابر اختلاف در ژلهاژ مقايسه شده دارند. وقتي که گروه خاصي از نقاط انتخاب شدندتغييرات در شاخص هاي نقاط, مثلا" دانسيته نوري يا حجم نقاي, به صورت هيستوگرامهايي نشان داده خواهند شد. گزارش هاي آماري حاوي پارامترهاي آماري نظير ميانگين ها, انحراف معيار و وارياسيون ايجاد مي شود. و آمارهاي ساده اي چون آزمونStudent�s t-test نيز در اين نرم افزار ها اجرا مي شوند.
با توجه به تعداد نقاط بسيار زياد ةاهر شده بر روي ژل الکتروفورز دو بعدي, بهترين روش آناليز با استفاده از کامپيوتر صورت مي پذيرد. با استفاده از ابزار کامپيوتري مي توان حتي نقاط کمرنگ را تشخيص داد و تعيين اندازه کرد, تصاوير ژل هاي متفاوت را با يکديگر مقايسه نمود و تغييرات کمي بيان پروتئين ها را در ژل هاي تهيه شده از يک نمونه در شراطي متفوت را مشخص نمود. چندين نرم افزار مطرح براي چنين کاربردي در بازار موجود است:Z3 ساخت Compugen, Melanie V از Genbio و Amersham و PD Quest از BioRad. تمامي اين نرم افزارها ابتدا تصوير ژل را در برنامه نشان مي دهندو قادر به ويراستن تصاوير در قالب TIFF هستند. سپس اين نرم افزارها به تشخيص نقاط مي پردازند, اطنکار به صورت خودکار صورت گرفته و قابليت ويراستاري دستي را دارند. با تنظيم نحوه ي تشخيص نقاط مي توان اين نحوه را براي يک سري از ژلها اعمال کرد. بعد از اين مرحله نرم افزارها شروع به تطابق نقاط يکسان بر روي يک سري از ژل هاي مورد نظر و انتخاب شده مي نمايند. اولين مرحله در اين کار تعيين يکي از ژل ها به عنوان ژل مرجع است. در ژل مرجع چندين نقطه ي پروتئيني به عنوان نقاط اصلي به منظور پيدا کردن جفت هاي يکسان آنها بر روي ژل هاي ديگر تعيين مي شوند. سپس تطابق نقاط جفت شروع مي شود. با انجام اين مرحله نطابق کل نقاط ژل ها شروع خواهد شد. بعد از اين مرحله ويراستاري و تصحيح دقيق تطابق هاي انجام شده صورت مي گيرد. اين مرحله براي افزايش دقت در مقايسه بين ژل ها ضروري است. يکي از توانايي هاي اين نرم افزارها امکان ايجاد ژلهاي مصنوعي يا ژلهاي ميانگين Average gels با استفاده از ژلهاي تطابق يافته حاصل از يک نمونه در يک وضعيت مشخص است. اين ژلهاي ميانگين براي بررسي تغييرات در بيان پروتئين در بين دسته هاي مختلف ژلها بسيار کار آمد هستند.
برخي مواقع در تصاوير ژلهاي الکتروفورز دو بعدي اختلاف در شدت نقاط ناشي از اختلاف در بيان پروتئين ها نيست, بلکه اختلاف در آماده سازي نمونه, ميزان بارگيري, نحوه ي رنگ آميزي و حتي تصوير برداري موجد اين اختلاف است. درچنين مواردي نرم افزار ها قادر به نرماليزه کردن تصاويز برای جبران اين اختلاف در شدت نقاي هستند. اينکار توسط رجوع به نقاطي مي شود که از عدم تغيير در ميزان آنها در طي آزمايشهاي مختلف اطمينان وجود دارد.
در نهايت آناليز اطلاعات شروع خواهد شد. در ابتدا نقاطي نشان داده مي شوند که براي آنها ويژگي خاصي تعريف شده باشد, مثلا" نقاي تطابق يافته اي که بيش از دو برابر اختلاف در ژلهاژ مقايسه شده دارند. وقتي که گروه خاصي از نقاط انتخاب شدندتغييرات در شاخص هاي نقاط, مثلا" دانسيته نوري يا حجم نقاي, به صورت هيستوگرامهايي نشان داده خواهند شد. گزارش هاي آماري حاوي پارامترهاي آماري نظير ميانگين ها, انحراف معيار و وارياسيون ايجاد مي شود. و آمارهاي ساده اي چون آزمونStudent�s t-test نيز در اين نرم افزار ها اجرا مي شوند.